左归丸对大鼠胸腺细胞凋亡及bcl

《左归丸对大鼠胸腺细胞凋亡及bcl》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、左归丸对大鼠胸腺细胞凋亡及Bcl：龚张斌徐品初金国琴【摘要】目的观察左归丸干预皮质酮致大鼠胸腺细胞凋亡及对Bcl-2、Bax表达的影响。方法1×10-5mol/L皮质酮处理乳鼠胸腺细胞。实验分为正常对照组，模型组，左归组。AnnexinV-PI双染色法结合FCM检测胸腺细胞凋亡情况;RealtimePCR和ethodsTheZGPcontainedratserumocytesodel,ZGPgroups.TheeffectofapoptosiseasuredbyAnnexinV-FITC/PIdoublestainingandFCM.TheexpressionsofBcl　

2、　-2,Baxeasuredbyreal-timePCRandSO)配制成储液，-20℃冰箱保存，试验时用RPMI-1640培养基稀释(DMSO终浓度<0.5%);兔抗大鼠Bcl-2单克隆抗体、兔抗大鼠Bax单克隆抗体购自SantaCruz公司;小鼠抗大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酸(GAPDH)单克隆抗体购自CellSignaling公司;Real-timePCR引物由上海生工生物科技有限公司合成。　　1.1.3主要仪器　RealPlex4型荧光定量PCR仪(EppendorfCO.，LTD);500型流式细胞仪(BeckmanCoulterCO.，LTD)。　　1.2方

3、法　　1.2.1含药鼠血清的制备选用150～170g大鼠，分左归组和空白组，按文献方法〔3〕制备左归丸鼠血清和空白鼠血清。　　1.2.2胸腺基质液的制备无菌条件下，取24h乳鼠胸腺，按文献方法〔4〕培养胸腺基质细胞，待细胞长满培　养板孔的80%后，完全换液，继续培养48h，收集培养上清液，0.22μm滤器过滤，-20℃保存，备用。　　1.2.3原代培养胸腺细胞取24h乳鼠胸腺，制备胸腺单细胞悬液。应用大鼠淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。RPMI-1640培养基稀释单细胞悬液至密度为5×106个/ml，接种于6孔培养板，置37℃，5%CO2培养箱里孵育。24h后，洗涤细胞，进行后

4、续实验。　　1.2.4　分组及药物处理正常对照组：含15%空白鼠血清;皮质酮处理组(简称模型组)：含1×10-5mol/L皮质酮药液，15%空白鼠血清;皮质酮加左归丸血清组(简称左归组)：含1×10-5mol/L皮质酮药液，15%左归丸鼠血清。以上各组均含40%胸腺基质液。药物处理96h　　后收集细胞，进行指标检测。　　1.2.5观测指标膜联蛋白V/碘化丙啶(AnnexinV/PI)双染色法及流式细胞仪分析：根据试剂盒实验方法，细胞固定，染色，行流式细胞光度仪(FCM)分析。激发波长Ex=488nm;发射波长Em=530nm。AnnexinV-FITC的绿色荧光通过异硫氰酸

5、荧光素(FITC)通道(FL1)检测;PI红色荧光通过PI通道(FL3)检测。每管样品检测10000个细胞，全部数据经Beckman流式细胞仪自带软件获取和分析。Real-timePCR检测胸腺细胞各目的基因mRNA表达：TrizolReagent抽提总RNA，合成cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR反应。Bcl-2引物：上游引物：5′-TGCGCTCAGCCCTGTG-3′，下游引物：5′-GGTAGCGACGAGAGAAGTCATC-3′。Bax引物：上游引物：5′-CAAGAAGCTGAGCGAGTGTCT-3′，下游引物：5′-CAATCATCCTCTGCA

6、GCTCCATATT-3′。内参GAPDH引物：上游引物：5′-GGTATCGTGGAAGAACTCATGAC-3′，下游引物：5′-ATGCCAGTGAGCTTCCCG　　TTCAC-3′。扩增条件：94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环。RNA琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。采用SYBRGreen荧光定量PCR试剂盒，取各组cDNA模板，利用RealTime-PCR检测目的mRNA的Ct值。反应体系为：2×SYBRGreenPCRMasterMix12.5μl，前向引物(10μmol/L)1μl，反向引物(10μmol/L)1μl，反转录

7、产物(0.2μg)5μl，焦碳酸二乙酯(DEPC)-ddH2O加至25μl，混匀，取20μl，加入PCR管中。最佳反应条件为：95℃2min，95℃15s，60℃25s，72℃45s，共40个循环。每组待测样本设立6个重复，全部反应结束后，按公式：Ratio=2-△△C　t︱△△Ct=〔△Ct_Sample-△Ct_NegativeControl〕计算mRNA变化值。x【关键词】胸腺细胞;左归丸;凋亡;Bcl-2;Bax　【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheacmodationan