组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素a联合全反式维甲酸诱导plzfrarα阳性u937细胞分化

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1、组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A联合全反式维甲酸诱导PLZFRARα阳性U937细胞分化【摘要】目的：研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A(TSA)和全反式维甲酸(ATRA)对PLZFRARα阳性细胞的作用.方法：稳定转染PLZFRARα基因的U937细胞(U937/PLZF)经TSA,ATRA作用一段时间后，TT法检测细胞生长和增殖状态，流式细胞仪检测细胞周期和细胞表面分化抗原CD11b，CD64，CD14等的表达，荧光免疫细胞化学染色检测融合蛋白表达，细胞化学染色和硝基蓝四氮唑(NBT)还原试验观察细胞功能分化情况.结果：U937/PLZF细

2、胞在去除四环素条件培养后，PLZFRARα表达明显增加.TSA(30μg/L)联合ATRA(1μmol/L)使U937/PLZF细胞核质比缩小，生长增殖受抑，S期细胞减少，CD11b表达增高，PLZFRARα蛋白表达减弱，分布以胞核弥漫细小颗粒为主，细胞功能上的分化可能尚不成熟.结论：组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA联合ATRA可使U937/PLZF细胞发生部分分化.【关键词】PLZF；维甲酸；组蛋白去乙酰化酶；分化；白血病,早幼粒,急性　　【Abstract】AIM:Toinvestigateeffectsofalltransretinoicaci

3、d(ATRA)andtrichostatinA(TSA),ahistonedeacetylaseinhibitor,onPLZFRARαpositivecells.METHODS:PLZFRARαpositiveU937cells(U937/PLZF)odel.Thechangeofcellmorphologysastaining,cellgroethylthiazolyltetrazolium(MTT)assay,cellcycledistributionandexpressionofcellmembranesurfacedifferenti

4、ationrelatedantigens(suchasCD11b,CD64andCD14)inedbyfloetryassay.ExpressionofPLZFmunofluorescence.Functionaldifferentiation(NBT)reductionabilityandcytochemicalstaining.RESULTS:TT法检测细胞生长按照文献［2］方法操作，570nm处测A值.细胞生长抑制率=（1-处理组平均A值/对照组平均A值）×100%.重复3次取平均值.　　1.2.2流式细胞仪检测细胞周期及凋亡取约1×106细胞

5、，冷乙醇固定，Rnase(终浓度200mg/L)消化，20mg/L碘化丙啶(PI)染色30min，用流式细胞仪(BeckmonCoulter)检测细胞不同DNA含量分布，经Multicycle软件分析细胞周期和凋亡细胞.　　1.2.3检测细胞表面分化抗原取细胞悬液100μL（约含5×105细胞），加入FITC或PE标记的鼠抗人CD11b，CD64，CD14mAb和相应的同型抗体（同种荧光标记的非特异性鼠抗人IgG1，IgG2α）（均购自CoulterImmunotech,France），室温下避光孵育30min，PBS清洗，重悬细胞，立即进行流式细

6、胞仪检测.　　1.2.4检测融合蛋白表达细胞涂片，-20℃预冷甲醇/丙酮(1∶1)固定液浸泡固定5~10min,PBS浸洗，30g/LBSA封闭，一抗(goatantiPLZF,SantaCruz)室温孵育1h，PBS洗5min×5次，二抗(FITCrabbitantigoatIgG)室温孵育1h，PBS洗5min×5次，PI复染，封片，激光共聚焦显微镜下观察.　　1.2.5细胞化学染色氯乙酸ASD萘酚酯酶染色(CE),醋酸ASD萘酚酯酶染色(AE),过碘酸席夫试验（糖原染色，PAS）,过氧化物酶染色(POX)，按照常用方法进行.　　1.2

7、.6硝基蓝四氮唑还原试验取约1×106细胞，PBS清洗后加入硝基蓝四氮唑(NBT)反应液，37℃孵育30min，混悬细胞，离心(500r/min×5min)涂片，光镜下计数阳性细胞率，每个视野至少计数200个细胞.　　2结果　　U937/PLZF细胞在添加0.5mg/L嘌呤霉素(puromycin),0.1mg/L四环素(tetracycline)和1g/LG418培养液中维持培养，PLZFRARα呈低水平表达.撤去四环素后，PLZFRARα的表达明显增加.　　2.1细胞形态学变化单独使用TSA(30μg/L)或ATRA(1μmol/L)处理表达P

8、LZFRARα的U937/PLZF细胞，24~72h形态变化不甚明显；当二者合用时，细胞核质