实验九血清补体活性测定

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1、医学免疫学实验指导实验九血清补体活性测定由长沙达尔镊生物科技有限公司整理【文章介绍】实验是映证理论，对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段。BioRike博瑞克根据《医学免疫学实验指导》一书系统整理了14个实验项目，每个实验说明实验目的，实验原理，实验内容方法，实验要求及注意事项，希望广大师生能够从中有所收获。BioRike简介：BioRike（中文简称"博瑞克"）是长沙达尔锋生物科技有限公司旗下的产品品牌，甶旗下专业的生命科学实验室BioRike博瑞克研发和生产。BioRike是一家致力于生命科学和生物技术领域的高科技实验室，专门从事以Elisa试剂盒、抗体、细胞因子、免

2、疫检测试剂盒、血清等免疫学产品为主的生物试剂的研发与销售。【实验目的】掌握CH50实验的原理，熟悉其方法及意义，【实验原理】补体能使溶血素（抗绵羊红细胞抗体）致敏的绵羊红细胞（SRBC）发生溶血，当致敏的绵羊红细胞浓度恒定时，溶血程度与补体含量和活性呈正比例关系。因此，将新鲜待检血清做不同稀释后，与致敏红细胞反应，测定溶血程度，以50%溶血时的最小血清量判定终点，可测知补体总溶血活性。补体活性与溶血程度的关系呈"S"形曲线。在50%溶血周围，线段近似一条直线。因此当补体用量稍有变动，就可对溶血程度发生很大影响。所以用50%溶血作为终点要比100%溶血更为敏感。［材料］1.待检人血清

3、：静脉抽血，待凝后立即分离血清进行测定或-70°C保存。2.缓冲盐水（pH7.4）:取NaCI75g，lmol/LHCI177ml，三乙醇胺28ml,MgCI2.6H2Ol.Og,CaCI2-2H2O0.2g。先将NaCI溶于700ml蒸馏水中，再加入HCI和三乙醇胺。将MgCI2*6H2O和CaCI2-2H2O分别用2ml蒸馏水溶解后，逐一加入，再用蒸溜水加至1000ml,4°C保存。临用前取上述溶液1份加9份蒸馏水，4°C保存待用。3.2%SRBC悬液：新鲜脱纤维羊血或Alsever液保存羊血（4°C可保存3周）用生理盐水洗2次，第三次用缓冲盐水^OOOrpm离心30min。取

4、压积红细胞以缓冲盐水配成2%悬液。为使浓度标准化，可将2%SRBC悬液用缓冲盐水稀释25倍，于分光光度计（542nm）测定透光率（以缓冲盐水校正透光率至100%X每次实验用红细胞浓度（透光率）必须一致。4.生理盐水5.溶血素（anti-SRBC）:按说明书所标效价以缓冲盐水稀释至2单位。如效价为1:8000，使用时1:4000稀释。6.致敏SRBC:2%SRBC加等量2单位溶血素，混匀，置37°C水浴10min。7.50%溶血标准管：取2%SRBC悬液0.5ml,加入蒸馏水4.5ml，混匀。8.37°C水浴箱。9•离心机10•分光光度计11.试管、吸管【方法】1.取待检人血清0.2

5、ml,加入缓冲盐水3.8ml，使成1:20稀释。2.按下表所示加入各试剂，混匀，将试管置于37°C水浴30mino试苷编号1：20稀释血清(ml)缓冲盐水(ml)致敏SRBC(ml)CH5O(U/ml)10.101.401.020020.151.341.013330.201.301.010040.251.251.08050.301.201.066.660.351.151.057.170.401.101.05080.451.051.044.490.501.001.04010一1.501.0一表CH50法测定总补体活性操作【结果】将各试管2500rpm离心5min,取上清液与50%溶血

6、标准管目视比较，观察溶血程度。取与50%溶血标准管相接近的两管在分光光度计上分别读取光密度值A542nm(0.5cm比色杯，以缓冲盐水作为空白调零)，以最接近50%溶血标准管的一管，按下列公式计算CH50活性。CH50(U/ml)=1/引起50%溶血管的血清量(ml)x20(稀释倍数)本法测定的正常值范围为50-100U/ml。［讨论］1•操作注意事项(1)待检血清标本应无溶血、无乳縻、无污染。(2)缓冲液、致敏SRBC均应新鲜配制，缓冲液若被细菌污染，会导致自发溶血。(3)待检血清标本必须新鲜，如室温放置2h以上，会使补体活性下降。(4)实验所用玻璃器皿，一定要清洁，酸碱均能影响

7、测定的准确性。(5)测定需在0°C-4°C进行，试管需预冷，可保持补体活性。(6)补体的溶血活性与反应时缓冲液的pH、离子强度、钙镁离子量、羊红细胞量、反应总体积及反应温度均有一定关系，因此实验时需对反应的各个环节做严格控制。2.方法学评价(1)本法简便快速，但敏感性较低，不能测定补体蛋白的绝对值。(2)总补体活性的测定主要反映补体C1〜C9通过经典途径活化的程度。3.临床意义(1)在急性炎症、感染、组织损伤(如风湿热急性期、结节性动脉周围炎、皮肌炎、伤寒、Reite