26蜂毒肽与il

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1、26蜂毒肽与IL.freelelittinandinterleukin-2influencedthegroelittinandinterleukin-2onthegroancervicalcancercellinvitro.MethodsTheanti-tumoractivityofthefusionproteinofmelittinandinterleukin-2ethod，anditsinfluenceonthemorphologyofHeLacellorphologicchangesinopticmicroscope.ConclusionThefusionproteinofmelitt

2、inandinterleukin-2couldinhibittheproliferationofHeLacell.【Keyelittinandinterleukin-2HeLacellMTT蜂毒溶血肽(melittin)是蜂毒的主要组分.freela公司产品；96孔培养板，Coster公司产品；嵌合蛋白，本室构建。1．2细胞株HeLa细胞株购自山东省医学科学院药物研究所，RPMI-1640基础培养液中加入10%新生牛血清，1×105U/L青霉素，100g/L链霉素，置37℃5%CO2孵箱中培养，3～4天传代1次。人成纤维细胞本室保存，传代培养同HeLa细胞。1．3仪器和设备酶联免疫检测仪系B

3、IO-RAD公司产品，CO2孵箱系美国SHELLAB公司产品，倒置显微镜系公司产品（OLYMPUS），电子分析天平（Sartorius），低温高速离心机系德国Heracus公司产品。1．4细胞增殖试验取对数生长期的HeLa细胞，胰酶消化后10%的小牛血清的RPMI-1640培养液稀释细胞，制成5×105/L细胞悬液，加入96孔培养板中，每孔200μl，置37℃，5%CO2孵箱中培养12～24h后分别加入2.5，5.0，10，20，40mg/L不同稀释度的嵌合蛋白，并以阿霉素（20mg/L）作阳性对照，生理盐水作阴性对照。同时以正常人二倍体成纤维细胞作细胞对照。每个浓度设6个复孔，置37℃，5

4、%CO2孵箱中继续培养72h，培养结束前4h，每孔加入MTT20μl，37℃培养箱中培养4h，离心弃上清后每孔加二甲基亚砜200μl，微量振荡器振荡5min，自动酶标读数仪比色(波长570nm)，测吸光度并计算嵌合蛋白对HeLa细胞的抑制率，求IC50。HeLa细胞抑制率=1-（实验组吸光度值/对照组吸光度值）×100%。1．5光镜形态学观察细胞接种在放有盖玻片的6孔培养板中培养，待细胞生长至对数生长期，加入不同稀释度的嵌合蛋白，继续培养，定时镜下观察。1.6统计学方法每份样本平行测定6孔，数据均以x±s表示。2结果2.1嵌合蛋白对HeLa细胞生长的抑制作用作用3天后高浓度组较低浓度组对细胞

5、的抑制作用增强，细胞抑制率见表1，各浓度组嵌合蛋白对人二倍体成纤维细胞均无明显影响。表1嵌合蛋白对HeLa细胞增殖抑制率的影响2.2倒置显微镜观察阴性对照组HeLa细胞生长良好，细胞伸展，呈不规则多角形。实验组培养24h后HeLa细胞数目减少，随着时间的推移，细胞明显皱缩，浆内出现空泡，胞内颗粒增多，培养液中有许多漂浮的呈桑叶状细胞，72h后上述改变更为明显。3讨论本实验选用通用癌细胞株HeLa细胞，并以正常人二倍体成纤维细胞作对照，应用MTT法研究了嵌合蛋白对HeLa细胞生长的影响。实验结果表明，嵌合蛋白对HeLa细胞的生长有抑制作用，10mg/L的嵌合蛋白对HeLa细胞有明显的抑制作用，

6、且随浓度及时间的增加抑制作用增强。同样条件下嵌合蛋白对正常人二倍体成纤维细胞的影响不明显。光镜观察结果显示嵌合蛋白作用24h后细胞出现形态学改变且随时间的增加更为明显。分子生物学研究表明，蜂毒肽具有膜活性特点，与膜作用时，随着时间的变化，四聚体衰变为稳定的三聚体和单体。这个持续的构型变化将伴随着含水孔的横向扩张，主要由α-螺旋之间的静电排斥造成孔增加，因此细胞裂解［5］。蜂毒肽具有对肿瘤细胞的选择性杀灭作用，又具有相对分子量小、热稳定性、无免疫原性等特点。IL-2是TC的淋巴因子，它能够增强LAK及NK细胞肿瘤杀伤活性［6，7］，具有高效的抗肿瘤作用。嵌合蛋白没有破坏IL-2的重要决定簇，同

7、时降低了蜂毒肽的毒性，嵌合蛋白能协同IL-2与蜂毒肽增强细胞免疫的作用，能特异并高效激活CTL对肿瘤细胞的杀伤。它基本保留了抗肿瘤效应，同时减轻了蜂毒素、IL-2对正常细胞的毒性，这种独特的双重作用有利于肿瘤病人的综合治疗和康复。嵌合蛋白作为一种高效、低毒的抗肿瘤药物，其确切的作用机制有待于进一步深入研究。【