第二章细胞生物学研究方法

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1、显微成像技术最早的光学显微镜是1590年的ZJanssen发明的，胡克和虎克对其进行了改造光学显微镜的分类：(1)根据成像的光学性质：可见光和不可见光显微镜(2)根据显微镜照明技术：明视野显微镜、暗视野、荧光显微镜(3)根据显微镜成像技术：相差显微镜、干涉显微镜、微分干涉反差显微镜、偏光显微镜。(4)根据显微镜的镜体构造分为：倒置显微镜、实体显微镜、比较显微镜、激光扫描显微镜。^足巨是透镜的中心平面到焦点的距离分辨率:分辨出相邻的两个物体简单的最小距离的能力(最重要的性质)R=0.61A/nsina其中a为角孔径的半角提高分辨率的方法：增大角孔径和增加介质的折射率，缩短波

2、长。可见光来说分辨相邻两点之间的最小间隔是0.2微米，称之为分辨极限普通光学显微镜的构成：照明系统、光学放大系统、机械系统常用的显微镜:荧光显微镜：紫外线为光源，用于研宄细胞内物质的吸收、运输以及化学物质的分布及定位，自发荧光和诱发荧光相差显微镜：能够观察无色透明活细胞中的结构，利用光的衍射和干涉使相位差变成振幅差，表现为明与暗的对比，相差板暗视野显微镜：加入滤光片，使被检物质在黑暗的视野中呈现明亮的像，用以观察未经染色的活体或胶体粒子。适合于观察活细胞中的细胞核、线粒体和液体介质中的细菌和霉菌等倒置显微镜：物镜和照明系统的位置进行了调换，可以放置培养皿，培养瓶等容器，直

3、接对培养的细胞进行照明和观察。激光扫描共焦显微镜：活体动态研究；结构-功能；静态-动态；定位-定量-定性研宄。光学显微镜的样品制备:(1)样品的固定：FI的是杀死细胞，稳定细胞内的化学成分(2)包埋和切片:液态的石蜡和树脂作为包埋剂(3)染色电子显微镜:光源：电子束真空系统；成像系统：物镜，中间镜和投射镜，记录系统：观察窗，荧光屏亚显微结构或超微结构：只能在电子显微镜下才能看到，在光学显微镜下观察不到的结构常用的电子显微镜：投射电子显微镜，扫描电子显微镜，扫描透射电镜，扫描隧道显微镜，原子力显微镜电子显微镜的样品制备：样品切片放在载网上负染色：只染背景不染样品，用重金属盐

4、进行染色喷镀技术：又称投影技术，增强背景和样品反差的方法冷冻蚀刻技术：样品不需要固定，脱水和包埋，对样品结构无损伤,更加接近自然状态，膜分子结构的唯一观察方法。细胞化学技术：(1)酶细胞化学技术：利用酶的特异性来显示酶在细胞A的定位(2)免疫细胞化学技术：利用免疫反应定位组织中或细胞中抗原成分分布的一类技术细胞分选技术:流式细胞仪对细胞或染色体进行分选，并对单个细胞进行定量分析，包括测量细胞的大小，形状，细胞DNA，RNA含量和细胞总蛋0。细胞工程技术:利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的手段，按照人们预先的设计，有计划的改变或创造细胞遗传性的技术。(1)细胞培养技术

5、：在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生长和生存的技术，在离体条件下观察和研究细胞生命活动的规律。体外培养的条件：营养、生存环境、废物的排除原代培养：直接从机体下取出细胞，组织器官后立即进行培养，十代以内的被称为原代培养细胞细胞系：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系细胞株：从一个经过生物学鉴定的细胞系由单细胞分离培养或通过筛选的方法由单细胞增值形成的细胞群成为细胞株动物细胞培养方法：细胞贴壁，接触抑制细胞融合与单克隆抗体技术：细胞融合：自发或人工诱导下，两个或多个细胞或原生质融合成一个细胞，生物、化学、电流单克隆技术：利用能产生抗体的B淋巴细胞和肿瘤

6、细胞进行杂交，利用肿瘤细胞的无限复制特性。显微操作术：在显微镜下对细胞进行操作的技术。利用显微操作仪。用于细胞核移植，基因注入，染色体微切和胚胎切割等。分离技术：离心分离技术：不同的细胞器和分子有不同的体积和密度，在不同的离心力的作用下沉降分离，分类：速度离心和等密度离心，速度离心：根据被分离物质的体积差异，分为：差速离心，逐渐提高离心速度的方法分离不同的细胞器；移动区带离心等密度离心分离细胞器和大分子根据被分离物质的密度，重金属盐氯化铯是0前最好的离心介质，层析分离技术：凝胶过滤层析，亲和层析，离子交换层析光学显微镜和电子显微镜的主要区别：①照明源不同：光镜的照明源是可

7、见光，电镜的照明源是电子束；由于电子束的波长远短于光波波长，因而电镜的放大率及分辨率显著高于光镜。②透镜不同：光镜为玻璃透镜；电镜为电磁透镜。③分辨率及有效放大本领不同：光镜的分辨率为0.2Pm左右，放大倍数为1000倍；电镜的分辨率可达0.2nm,放大倍数106倍。④真空要求不同：光镜不要求真空；电镜要求真空。⑤成像原理不同：光镜是利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化成像；而电镜则是利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差成像。⑥生物样品制备技术不同：光镜样品制片技术较简单，通常有组织切片、细胞涂片、组强压片和细胞滴片等；