中华蜜蜂表皮蛋白基因之克隆与功能分析

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1、中华蜜蜂表皮蛋白基因之克隆与功能分析1前言1.1昆虫主要的表皮蛋白家族目前对昆虫表皮蛋白（cuticleproteins）的命名主要由首次测定其序列的研究者给出，大致分为以下几种情况（Magkrioti，2004）：（1）据表皮蛋白发现时的次序或者表皮蛋白的分子量来命名的，如EDG-91（EcdysoneDependantGene，其中91就是该蛋白质发现时的次序），LCP-14（LarvalCuticleProtein14；其中14就是该表皮蛋白质的相对分子量)；（2）根据表皮蛋白所在昆虫的种和属以及组织部位的第1个字母来命名，如Bm-

2、MLV、dNTP、T4DNA连接酶、DNAMarker、各种限制性内切酶等购自TaKaRa公司；反转录试剂盒EasyScriptFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix购于Transgen公司；DNA胶回收试剂盒购于Solarbio公司；质粒提取试剂盒PlasmidMiniKitI购自OMEGA公司；RNA提取用TRIZOLKit为LifeTechnology公司产品；cDNA纯化试剂盒ichelette和Soares（1993）的标准与要求，分别采集4-5日龄的幼虫（L4-L5）、预蛹期（PP）；一系列蛹期包括

3、白眼、粉红眼、深粉红色眼、棕眼（P，Pbd）；对刚出房的幼蜂进行标记以获得不同日龄的成虫（A1,A10,A30）。对于采集的各个阶段的中华蜜蜂进行解剖，尽量去除附着的肌肉和脂肪，以获得比较完整的表皮，从而获得进行不同发育时期表达量测定的样本，并立即进行液氮冷冻，于-80C保存备用。（2）中华蜜蜂不同组织部位的采集：将1日龄完整成虫进行解剖，将头部（head）、胸部表皮（thoracicepidermis）、腹部表皮（abdominalepidermis）、中肠（midgut）、肌肉（muscle）及马氏管（malpighiantubule

4、s）分离后于0.9%生理盐水中冲洗，立即液氮冷冻后，-80C保存备用。3.结果与分析...........453.1AccCPR1基因的特性分析.....453.2AccCPR2基因的特性分析.....554讨论..........674.1AccCPR1基因的分离与表达特性分析.....674.1.1AccCPR1基因的序列分析.......674.1.2AccCPR1基因的表达特征与角质层的发育....684.1.3蜕皮激素对AccCPR1基因表达的调控作用........694.2AccCPR2基因的分离与表达特性分析.....70

5、4.2.1AccCPR2基因的序列分析.......704.2.2AccCPR2基因的表达特征.......704.2.3蜕皮激素对AccCPR2基因表达的调控作用........714.2.4AccCPR2的抗逆性表达特性分析.....715结论......734讨论根据RR保守基序命名的CPR表皮蛋白家族是迄今为止最大的表皮蛋白家族，在节肢动物各个物种中均有发现，并且在与几丁质的结合中起主要作用（Iconomidouetal.,2005）。虽然昆虫中CPRs的分子特性与生物化学特性已被广泛的研究，但大多数研究集中于昆虫的模式生物物种，

6、比如果蝇（Drosophilamelanogaster）。然而，迄今为止在中华蜜蜂（Apisceranacerana）中CPRs还没有被报道过。为了研究在中华蜜蜂中CPR表皮蛋白的特性及其与蜕皮激素等环境刺激（非生物性和生物性）的关系，我们选择2个有代表性的CPR家族的表皮蛋白基因进行了克隆与鉴定，并根据各个基因的特殊性进行了有针对性的生物学特性研究。当前一个有效地对表皮蛋白基因进行命名的方法是，每个名称开头用三个或四个字母表示基因所在属/种的缩写，后面是蛋白家族的名称和该基因在这个家族中的编号（Willis,2010）；理想情况下，基因

7、应该根据它们在染色体上的顺序进行编号，但是有时某些表皮蛋白基因的注解先于整个完整基因组的装配。由于我们不知道对中华蜜蜂的完整的染色体基因的序列，我们将其分别命名为AccCPR1、AccCPR2，因为它们是在发现该物种的第一个和第二个CPR基因。.结论（1）本研究从中华蜜蜂中成功分离得到两个表皮蛋白家族基因，分别命名为AccCPR1和AccCPR2。氨基酸序列分析发现，两者同属于与几丁质结合的R＆R-2类型表皮蛋白，但在多肽链最保守基序（G-x8-G-x6-Y/F）上存在结构差异。（2）两个基因的第一个内含子都在编码5个氨基酸之后中断信号肽

8、，而这是昆虫CPR基因组序列的一个典型特征。启动子区域序列分析发现多个与发育相关的转录因子结合位点，表明两个基因可能在中华蜜蜂的变态发育中发挥了一定的作用。（3）不同时空表达特征分析表明，Ac