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1、ILKsiRNADNA表达载体的构建论文李敏侠，刘必成，张露，张晓良摘要目的：构建针对整合素连接激酶（ILK）mRNA的小干扰RNA（siRNA）表达载体，为抑制ILK在哺乳动物细胞内表达、研究其功能奠定基础。方法：合成含靶向ILK基因siRNA转录模板的茎环结构，与两端分别有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的Psilencer3.1质粒连接，大肠杆菌中扩增，测序鉴定。结果：转化大肠杆菌涂布平板长出阳性菌落,重组质粒电泳初步说明质粒构建成功,测序结果表明Psilencer3.1酶切位点BamHⅠ、HindⅢ之间有64bp的插入
2、片段.freelallinterferingRNA,siRNA）技术阻断特定基因的表达以来，RNA干扰（RNAinterference，RNAi）已发展成为一种经济、快捷、高效抑制基因表达的有力工具。siRNA是一种19个碱基互补配对、两端分别有两个碱基突出的2123nt的双链RNA,可以与细胞内核酶形成RNA诱导的沉默复合体（RNAinducedsilenceplex,RISC）。在其中一条RNA链的引导下，RISC特异性降解与siRNA同源的mRNA2。siRNA制备方法有多种，各有其优缺点，但若是在哺乳动物细胞内持续稳
3、定表达siRNA,长久抑制靶基因，以小的茎环结构RNA(shorthairpinRNA,shRNA)表达载体的方法和稳定筛选的技术最为有效34。整合素连接激酶（integrinlinkedkinase,ILK）是Hannigan等5于1996年首先发现的一种能与整合素结合的具有452个氨基酸残基的Ser/Thr蛋白激酶。有研究表明,ILK在肾小管上皮细胞间充质转分化（epithelialmesenchymaltransition,EMT）中发挥了重要作用6。本研究拟构建一个ILKsiRNA表达载体，用此载体转染肾小管上皮细胞
4、株，为应用RNAi技术抑制ILK表达,进一步研究ILK在肾小管EMT中的作用提供物质基础和技术支持。1材料与方法1.1材料Psilencer3.1H1Hygro即用型线性质粒购自Ambion公司，全长4552bp,两端分别带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点，并且带有潮霉素(hygomycin)和氨卞青霉素(ampicillin)抗性，适合进行稳定筛选。T4DNA连接酶和质粒提取试剂盒购自大连TaKaRa公司。菌株JMα由东南大学黏细菌发育研究室惠赠。ILKsiRNA转录模板7由上海申能博彩公司合成，RNAiILK目标序列为5
5、′TGACGAAGCTCAACGAGAA3′。1．2方法1．2．1茎环结构的设计所设计茎环结构序列长度为64bp的反向重复序列,.freelHⅠ、HindⅢ酶切位点，中间被9bp环结构分割。并以6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子，形成BamHⅠ＋Sense＋Loop＋Antisense+终止信号＋HindⅢ的结构。序列如下：正义链，5′GATCCGTGACGAAGCTCAACGAGAATTCAAGAGATTCTCGTTGAGCTTCGTCATTTTTTGGAAA3′；反义链，3′GCACTGCTTCGAGTTGCTCTTA
6、AGTTCTCTAAGAGCAACTCGAAGCAGTAAAAAACCTTTTCGA5′。1．2．2单链ILKsiRNA转录模板退火变成双链将合成的单链正义siRNA转录模板和单链反义siRNA转录模板用无菌双蒸水稀释成1μgμl-1,分别取2μl，加46μl退火缓冲液，配成50μl缓冲体系，置90℃3min，缓慢降温至37℃，37℃恒温1h。1．2．3ILKsiRNAPsilencer表达质粒构建取5μl退火反应液，加45μl无核酶去离子水，将退火后siRNA转录模板稀释成8ngμl-1,取1μl与线性空载Psilence
7、r3.1质粒1μl、T4DNA连接酶1μl、连接缓冲液1μl、无核酶去离子水6μl构成10μl反应体系，置8℃过夜。以不含Psilencer3.1的10μl连接反应体系作为对照。连接产物转化感受态大肠杆菌JMα,在含80μgml-1氨卞青霉素平板上37℃生长过夜。非转化大肠杆菌涂布平板作为阴性对照。挑取阳性克隆制备ILKsiRNAPsilencer重组质粒。1．2．4重组质粒鉴定Ambion公司环状Psilencer3.1质粒(negtivecontrolPsilencer3.1)作为marker与重组质粒同时作0.8%琼脂
8、糖凝胶电泳，粗略鉴定。若线性Psilencer3.1质粒中成功插入64bpsiRNA转录模板，则与NegativecontrolPsilencer3.1质粒只存在酶切位点之间DNA序列的不同，碱基数目和其余结构均相同，呈同样的超螺旋结构，所以在凝胶中的电泳速度相同，以此初步鉴定挑取的6个克
