液相色谱-质谱联用技术

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1、第三章液相色谱—质谱联用的原理及应用液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问题：不挥发性化合物分析测定；极性化合物的分析测定；热不稳定化合物的分析测定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。液相色谱-质谱联用要解决的重要问题液相色谱流动相对质谱工作条件的影响质谱离子源温度对液相色谱分析源的影响一、LC-MS联用的接口技术常用于液相色谱质谱联用技术的接口主要有移动带技术（MB）、热喷雾接口、粒子束接口（PB）、快原子轰击（FAB）、电喷雾接口（ESI）等。其

2、中，电喷雾接口的应用极为广泛。1.电喷雾（ESI）1）特点：具有高的离子化效率，对蛋白质而言接近100%；有多种离子化模式可供选择；对蛋白质而言，稳定的多电荷离子的产生，使蛋白质分子量测定范围可高达几十万甚至上百万；“软”离子化方式使热不稳定化合物得以分析并产生高丰度的准分子离子峰。2）ESI接口的结构ESI源主要由五部分组成：（1）流动相导入装置；（2）真正的大气压离子化区域；（3）离子取样孔；（4）大气压到真空的界面；（5）离子光学系统。电喷雾：现在常见的喷嘴是内径为0.1mm的金属毛细管。在它上面施加3～8kV的电压时。由于毛

3、细管的顶端很窄，形成的电场强度可高达106V/m。当流速为0.5～5μL／min的LC流出物溢出金属毛细管顶端时，会形成扇状喷雾。它是细小的液珠和溶剂蒸气的混合体。由于高压电场的作用，溶液中带某种电荷的溶质会向液体表面移动，使液珠表面该种电荷过剩。表面过量电荷的正负，视施加在毛细管电极上的电压正负而定。离子的形成：当表面带有大量电荷的精细液珠向下游移动时，溶剂迅速蒸发，液珠表面积不断缩小，电荷密度增高。当此情况达到Rayleigh极限时，液珠会分裂成更小的液珠。在质量和电荷重新再分配后，更小的液珠进入稳定态；然后再重复蒸发、电荷过剩

4、和液珠分裂。在整个过程的某个阶段，分析物可以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。离子的输送：大气压条件下形成的离子，在电位差的趋使下（当然也有压力差的作用）,通过取样孔（samplingcone）进入质谱真空区。离子流通过一个加热的金属毛细管，进入第一个降压区，在毛细管的出口处形成超声速喷射流。由于分析物带电荷并且动量大，可通过下游处于低电位的锥形分离器的小孔，进入第二降压区，经聚焦后进入质谱。而与分析物离子一同穿过毛细管的少量的溶剂，由于呈电中性而且动量小，则在第一和第二降压区被抽走。电喷雾电离源ESINeedle喷雾针多层套管构成

5、溶液雾化气（N2/Air）NebulizingGas干燥气DryingGas（N2）加快溶剂挥发电喷雾电离源ESITaylor锥库仑分裂Rayleigh稳定限形成正/负气相离子被吸入质量分析器电喷雾接口的主要缺点是它只能接受非常小的液体流量（1～10µL∙min1）将气动辅助电喷雾技术运用在接口中，使得接口可与大流量（约1mL∙min1）的HPLC联机使用2.大气压化学电离源（APCI）大气压化学离子化（APCI）技术应用于液-质联用仪是由Horning等人于20世纪70年代初发明的，20世纪80年代末得到突飞猛进的发展，与ESI源

6、的发展基本上是同步的。但是APCI技术不同于传统的化学电离接口，它是借助于电晕放电启动一系列气相反应以完成离子化过程，因此也称为放电电离或等离子电离。大气压化学电离是将化学电离原理延伸到大气压下进行的一种新的软电离技术，样品溶液从LC流出被气化后，溶剂分子在电晕放电探针处形成反应气等离子体，样品分子与反应气等离子体进行质子交换被电离，形成准分子离子[M+H]+或[M-H]-，最后，样品分子的准分子离子通过筛选狭缝进入质谱仪，整个过程在大气压条件下完成。APCI是一种软电离接口技术，电离过程中只产生单电荷峰，非常适合弱极性小分子化合物

7、的测定。另外，APCI还与高流量的梯度洗脱兼容，通过调节离子源电压，可以得到不同断裂程度的质谱图。优点：形成的是单电荷的准分子离子，不会发生ESI过程中因形成多电荷离子而发生信号重叠、降低图谱清晰度的问题；适应高流量的梯度洗脱的流动相；采用电晕放电使流动相离子化，能大大增加离子与样品分子的碰撞频率，比化学电离的灵敏度高3个数量级。大气压化学电离源APCINeedle喷雾针（加热）CoronaNeedle电晕针reagentgas试剂气离子-分子反应电喷雾与大气压化学电离的比较电离机理：电喷雾采用离子蒸发，而APCI电离是高压放电发生

8、了质子转移而生成[M＋H]+或[M-H]-离子。样品流速：APCI源可从0.2到2mL／min；而电喷雾源允许流量相对较小,一般为0.2-1mL／min.断裂程度；APCI源的探头处于高温，对热不稳定的化合物就足以使其分解.灵敏度：通