丙氧鸟苷对转tk基因的人外周血单个核细胞的毒性作用论文

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1、丙氧鸟苷对转TK基因的人外周血单个核细胞的毒性作用论文.freelonocytes;gancicloirAbstract:AIMToexploretheia（GVL）effectmaximallyinallogeneichematopoieticstemcelltransplantation.METHODSViralthymidineki-nase（TK）gene，greenfluorescentprotein（GFP）geneandthebacterialneomycin-resistance（NeoR）geneanp

2、eripheralbloodmononuclearcells（PBMC）ajortransducedcellseoftheinfectedtargetcells，integratedNeoRgeneinatedTK-transducedTlymphocyteincaseGVHDdevelopsispos-sible.0引言逆转录病毒载体介导的基因转移是近年发展起来的基因转移技术［1］.随着干细胞移植治疗恶性血液病的广泛深入，寻求减少移植物抗宿主病（GVHD），同时最大限度发挥GVL效应的方法是干细胞移植的重要课题之一［2

3、］.我们以逆转录病毒载体介导将HSV-TK基因导入人外周血单个核细胞（PBMC），观察其表达及丙氧鸟苷（GCV）对转化细胞的毒性作用.1材料和方法1.1材料DMEM培养基（粉剂），由Gibco公司出品;rhIL-2购自北京中化合通药业有限公司，批号960310;CD3mAb由军事医学科学院生产;PHA-P，噻唑蓝由Sigma公司出品，购自北京天象人生物工程公司;藻红素（PE）标记鼠抗人CD3，CD4，CD8，CD19，CD33mAb购自深圳晶美生物工程有限公司;GCV购自罗氏药业有限公司.PA317/GCGFPPT-SN

4、为含GFP基因、HSV-TK基因、NeoR基因的逆转录病毒包装细胞株、NIH3T3细胞株，均由上海东方肝胆外科医院钱其军博士惠赠.1.2方法PA317/GCGFPPTSN包装细胞在含500mgL-1G418的DMEM中培养，培养条件为37℃，50mLL-1CO2饱和湿化空气中培养.基本成层后，弃上清，换用无G418的新鲜培养液继续培养18～24h后，收集上清，以NIH3T3细胞株检测病毒滴度.病毒效价=集落数×上清稀释倍数（×103CFUL-1）.取健康志愿献血者外周血5～8mL，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞

5、，用生理盐液洗2遍，悬浮于2mgL-1PHA:10μgL-1CD3mAb:5×105UL-1rhIL-2和200mLL-1胎牛血清的DMEM培养中，置37℃，500mLL-1CO2的饱和湿度培养箱中培养3～5d.取上述培养3～5d的PBMNC悬浮于8mgL-1polybrene，100mgL-1rhIL-2的病毒上清，孵育8～12h后，去除病毒上清及polybrene，加入含200mLL-1胎牛血清的新鲜培养液，1～2d后，重复上述步骤，继续与病毒上清孵育、去除病毒上清、加新培养液，如此反复转染2～3次.转染病毒滴度与细

6、胞比为10∶1.1.2.1倒置显微镜观察取转染后细胞制成细胞悬液，相差镜头下观察，计数视野中细胞数，转换荧光光源，观察GFP所发出的绿色荧光，计数荧光细胞数.1.2.2FACS分析取转染细胞分加于6支试管，每管约2×105细胞，一管为阴性本底，其余5管分别用PE标记鼠抗人CD3，CD4，CD8，CD19，CD33mAb进行细胞表面抗原标记.参照检测异硫氰酸荧光素（FITC）的常规方法（其激发波长475nm，发射波长490nm），调整流式细胞仪工作条件至GFP，工作电压525V，各管分别获取10000个细胞.1.2.3细胞

7、基因组DNA提取与外源基因整合鉴定PCR检测NeoR基因，常规方法进行转染后外周血单个核细胞基因组DNA提取，并以此DNA为模板，用NeoR基因引物进行PCR扩增（产物790bp）.P1:5’CAAGATGGATTGCACGCAGG3’，P2:5’CCCGCTCAGAAGAACTCGTC3’.反应条件:95℃水浴变性5min，加Taq酶2.5U，然后进行28个循环反应（55℃1min，72℃1min30s，94℃1min），接55℃1min，最后72℃延伸10min，PCR产物经10gL-1琼脂糖凝胶电泳鉴定.1.2.4

8、GCV抑制率测定将转染细胞与未转染细胞1×105接种于24孔培养板，同时加rhIL-21×105UL-1，设阴性对照孔，将0.1，1，10mgL-1三个剂量GCV加入转染细胞孔中，以此为实验孔，每孔设4个复孔，培养72h后，分别于相差显微镜下观察其形态变化.GCV对转染细胞生长抑制率采用MTT法［3，4］，DG-30