丝蛋白基因分子设计及过表达raslca基因提高实用品种产丝量研究

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1、丝蛋白基因分子设计及过表达RaslCA基因提高实用品种产丝量研究第一部分文献综述第一章基因打靶技术的研究进展目前已有600多种构建好的Gal4品系，能够分别在果蝇不同组织系统和不同发育时期表达Gal4蛋白。1997年，Hidalgo和Brand证明可利用Gal4/UAS系统表达外源致死基因，因为在没有Gal4的情况下，致死基因不会被启动而表达[19]；2003年，Imamura等提出可在家蚕体内利用Gal4/UAS系统，在时间空间特异性的表达外源基因[20]；四年后，Viktorinová与R-Gal4两个Gal4品系，eyGal4使靶基因在果

2、蝇眼原基细胞增殖期高表达；pGMR-Gal4则可以使靶基因在果蝇眼原基形态发生沟形成之后细胞分化期高度表达；然后同UAS靶基因品系杂交，结果后代观察到靶基因在与特异启动子相对应的组织中表达[24]。同年，Ma等在果蝇中建立了54个UAS-转基因系，用来大量表达人类基因[25]。Gal4/UAS双色荧光系统建立后，首先被用来研究保幼激素讲解途径的关键酶jhe(JH-specificesterase)在全体过表达时的情况[26]。将这两种载体连同辅助质粒分别进行转基因后，得到Gal4阳性品系及UAS阳性品系。把这两种品系进行杂交，根据孟德尔遗传定律可得到四种基因

3、型：野生型，Gal4单阳性，UAS单阳性，及Gal4/UAS双阳性。这四种基因型可通过眼部荧光的表达情况区别出来。发现Gal4/UAS双阳性转基因家蚕在三龄即表现上蔟及化蛹行为，检测同一龄期四种基因型jhe的转录水平比其它三种基因型高9-10倍。为今后利用PiggyBac为基础的Gal4/UAS系统研究鳞翅目昆虫生理提供了有力佐证。2基因打靶家蚕研究的现状从目前的研究来看，大部分的打靶载体是以家蚕丝腺基因为同源臂的，且已有相关打靶成功的报道。但与以piggyBac转座子介导的家蚕转基因相比，研究的深度和广度仍欠缺，能够运用的载体也较少。1999年，张锋等曾用

4、家蚕丝素重链基因5'和3'端序列的构建打靶载体，对重链进行基因打靶，尽管获得了能正常发育至5龄的转基因家蚕，但该转基因蚕不能正常吐丝传代，可能与二硫键的破坏有关[39]。同年Yamao等[40]将GFP基因与fib-L的第7外显子融合，构建含有丝素蛋白轻链基因的5'端序列-GFP序列-轻链基因3'端序列的重组AcMNPV，5龄第1天雌蚕皮下接种感染，通过GFP两端的丝素轻链基因作为同源重组臂将GFP基因打靶进蚕卵母细胞基因组丝素轻链中，得到能发绿色荧光的转基因蚕，并通过PCR，SouthernBlot，anacidicfibr

5、oblastgrowthfactor,aFGF）基因与丝素轻链基因的第7外显子融合构建基因打靶载体（图3）对家蚕丝素轻链基因进行打靶，获得了在丝腺组织分泌表达aFGF的基因打靶家蚕，但是在G3代，外源基因的表达水平明显下降。第二章抗菌肽的研究进展1抗菌肽的抗菌机制抗菌肽基因工程的研究存在以下困难：（1）抗菌肽有较强而广谱的抗菌、抗病毒能力，因此不可能利用常规的细菌、病毒作为表达体系；（2）抗菌肽的分子量较小，分离纯化较难；（3）抗菌肽内部常含有甲硫氨酸，作为融合蛋白表达时，不易用溴化氰裂解法将融合蛋白裂解。因此，通过免疫昆虫来获得天然抗菌肽就成为迫切需求。该

6、方法由于减少了人为影响，具有可靠的生态安全性等特点而具有举足轻重的作用。蚕业是我国的古老产业，拥有5000年的悠久历史，且我国蚕业具有蚕桑品种饲养技术成熟、成本低廉、资源丰富、科研力量雄厚以及产业化程度高等优势，利用家蚕作为生物材料进行抗菌肽的科研与生产具有其他昆虫无法比拟的优势，因此，抗菌肽的研究与应用对于21世纪的医药、食品防腐等领域的发展具有重要意义。为此，在以后的工作中有必要在以下两方面进行深入探索：（1）抗菌肽在蚕桑病害防治方面的研究；（2）借鉴家蚕一杆状病毒表达载体系统的研究方法来获得大量的抗菌肽。通过这些研究工作的深入开展，家蚕抗菌肽必将产生更

7、大的社会效益和经济效益[22]。2.Fib-L融合gfp及抗菌肽的转基因家蚕的设计与制作由piggyBac转座子介导的转座是将外源基因是通过剪贴的方式优先插入基因组的TTAA位点[8]，因此难以对基因组进行定向改造。在通过piggyBac转座子载体介导获得的转基因家蚕基因组中，原有的丝素蛋白基因并没有被替换，这种转基因家蚕所产的蚕丝中仍含有大量野生型的蚕丝蛋白。基因打靶是利用基因转移方法，将外源DNA序列导入靶细胞后，通过外源DNA序列与受体细胞内染色体上同源DNA序列之间的重组，将外源DNA定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，或对某一预先确定的靶位点进

8、行定点突变，从而改变细胞遗传特性的方法，利用该技术已