apoptin基因诱导a375细胞凋亡信号转导机制论文

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1、Apoptin基因诱导A375细胞凋亡信号转导机制论文【关键词】肿瘤特异性凋亡基因;细胞;凋亡;半胱天冬蛋白酶,摘要:目的研究肿瘤特异性凋亡基因(apoptin)在诱导人黑色素瘤细胞A375凋亡中的信号转导机制。方法用含有apoptin基因的真核表达载体瞬间转染体外培养的人黑色素瘤细胞A375;采用RT-PCR、DNA凝胶电泳、流式细胞仪分析检测A375的细胞的凋亡;以比色法检测半胱天冬蛋白酶8(caspase-8)和caspase-3的相对活性。结果Apoptin基因瞬间传染的A375细胞可出现典型的细胞凋亡所具有DNA梯状带;流式

2、细胞术发现实验组细胞凋亡率明显高于其他各组(P001);Caspase-3的活性升高,但caspase-8活性没有明显变化。结论Apoptin基因可通过激活caspase-3诱导人黑色素瘤细胞A375凋亡。关键词:肿瘤特异性凋亡基因;细胞;凋亡;半胱天冬蛋白酶StudyonsignaltransductioninapoptosisofhumanmelanomacellsA375inducedbyapoptinLabofMolecularBiology,CenterforDiseaseControlandPrevention,Sheny

3、angMilitarymand(Shenyang110034,China)Abstract:ObjectiveTostudyanmelanomacellsA375viatheactivationcaspase-8andcaspase-3.MethodsThehumanmelanomacellsA375id,easuredbyDNAagaroseelectrophoresis,RT-PCRandfloetry.Caspase-8andcaspase-3relativeactivityetricassayatvarioustime.Res

4、ultsTheapoptingenecouldinduceapoptosisofhumanmelanomacellsA375invitroandthemRNAofapoptingenecouldbedetectedbyRT-PCR.Theactivityofcaspase-3begantoriseinA375cellsaftertransfectedanmelanomacellsA375viaactivecaspase-3.Keyina、凋亡细胞DNA提取试剂盒(美国Invitogen公司);溴化丙啶(PI)和RT-PCR试剂盒(美国

5、Sigma公司);caspase-8检测试剂盒(美国Calbiochem-Novabiochem公司)和caspase-3底物AC-DEVD-pNA(英国Alexls公司);流式细胞仪(美国Coulter公司);550型酶标免疫测定仪(瑞典Bio-Rad公司)。其他化学试剂均为国产分析纯。质粒pcDNAA3由本室构建,内含肿瘤特异性凋亡基因,采用硷变性法大量提取质粒DNA,用PEG沉淀法进行纯化,所得质粒DNA含量为2g/L,纯度达到电泳纯〔5〕。人黑色素瘤细胞A375引自军事医学科学院。12方法121细胞瞬间转染参照Lipofect

6、amin转染说明书进行。转染前24h,将A375细胞重铺在T25培养瓶中,待细胞长至底面积80%时,进行转染。将10μlDNA和20μlLipofectamin各加入500μl无血清(DMEM)中,轻轻震荡5min,将二者混合即成转染液。室温静置20min,用无血清DMEM洗细胞2次,加入5ml无血清的DMEM,逐滴加入转染液,边加边轻轻混合,置37℃孵育8h。弃去转染液,换含100ml/L新生牛血清的DMEM培养液,继续培养。分别于转染后的不同时间,观察并取转染细胞进行鉴定,用等量的pcDNA31空质粒作转染对照。122RT-PCR

7、鉴定取1×106个转染不同时间的A375细胞,按异硫氰酸胍一步法,提取总RNA,作为RT-PCR的模板,用RT-PCR扩增ApoptincDNA〔6〕。123凋亡细胞DNA鉴定DNA凝胶电泳,取1×106个A375细胞,加入500μl细胞裂解液(10mmol/LTris-HCLpH74、10mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、150mmol/LNaCl、5g/L十二烷基硫酸钠(SDS)及400mg/L蛋白酶K),于50℃作用3h,不时振摇。加入等体积的平衡酚、氯仿-异戊醇抽提后,以2500r/min离心10min,加25倍无水乙

8、醇沉淀。用700ml/L乙醇沉淀、干燥后,将DNA溶入40μlTE液中,加入20μl的10g/LRnase,37℃水浴30min。取30μlDNA,进行15g/L琼脂糖凝胶电泳,细胞发生凋亡时可出现梯形条带。124apo

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