观察dna和rna在细胞中的分布

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1、观察DNA和RNA在细胞中的分布——Brachet反应光镜下常用的核酸染色方法Brachet反应的染色原理甲基绿（Methylgreen)和吡罗红(Pyronin,又译派若宁、派洛宁，又称焦宁）染色液（Unna试剂）的配制方法步骤及结果的比较可参考书目必修一实验三光镜下常用的核酸显色方法显示DNA——多用Feulgen反应:1N盐酸60℃水解8～10分钟(使DNA分子暴露出醛基)，水洗去盐酸后,用Schiff试剂染色该反应优点：1。专一性强2。可用于定性和定量分析显示RNA——多用Brache

2、t反应该反应优点：可同时显示DNA和RNA缺点：专一性不强（1。甲基绿、派若宁均为碱性染料，甲基绿单独使用时能使DNA和RNA均染成蓝绿色，派洛宁单独使用时能使DNA和RNA均染成红色。2。甲基绿同时可染其他物质如粘液)染色原理将甲基绿和派若宁配成混合染液（Unna试剂）时，甲基绿多和DNA选择性结合显示蓝绿色，派洛宁多和RNA选择性结合显示红色。其原因可能是当配成混合染液时，两种染料同时存在而出现竞争作用：甲基绿与DNA亲和力大,易和聚合程度高的DNA结合，而派洛宁与聚合程度较低的RNA结合。但空间构型不完

3、整的DNA也能与派洛宁结合显示红色。故用该法所得的红色反应来显示RNA的存在并不具有专一性。需做对照试验：利用专一性的RNA酶使嗜派洛宁染色性消减，这种反应具专一性，借助该反应才能说明被染上红色的确是RNA，故做对照实验是必要的。DNA染料一般认为甲基绿与DNA亲和力高、派若宁与RNA亲和力高的原因有两个：1、DNA和RNA分子的聚合程度不同，DNA比RNA聚合程度高。2、甲基绿分子的两个N基团正电荷的距离正好与DNA分子的负电基团间的距离相一致所以容易结合，而派若宁只有一个N基团正电荷，竞争不过DNA与甲基

4、绿的结合见上图）故一般认为甲基绿对DNA的结合能力主要与DNA分子的双螺旋空间构型的完整性有关甲基绿甲基绿生产厂家不同，甚至批号不同染色效果会有较大差别。商品甲基绿常混有甲基紫，会影响染色效果。甲基绿溶于水，不溶于氯仿（三氯甲烷）；甲基紫溶于氯仿。利用该特性可用氯仿洗脱甲基紫：将甲基绿水溶液放入分液漏斗，加入氯仿，用力振摇，然后静置，待溶液分层后弃氯仿。如此反复数次，直到氯仿不呈紫色为止。派若宁有PyroninY、B等，Y是四甲基化合物，B是四乙基化合物。有学者认为Y适用于该反应，B会使胞浆产生非特异性染色。

5、染色液（Unna试剂）的配制甲液：5%Pyronin水溶液（可加热助溶）6ml2%甲基绿水溶液6ml蒸馏水16ml乙液：1M醋酸盐缓冲液（pH=4.8）16ml（配方：A液：冰醋酸6ml加蒸馏水至100mlB液：醋酸钠13.6克加蒸馏水至100ml取A液40ml＋B液60ml混匀即为pH=4.8的缓冲液一周内有效，用前现配）甲乙两液分别置4℃冰箱备用，用时混匀。（上述配法参考汪德耀主编《细胞生物学实验指导》1981高教版其它配法可参考芮菊生等编著《组织切片技术》1980高教版）配制注意事项：①吡罗红（Pyro

6、nin）可加热助溶。②甲基绿(Methylgreen)批号不同，染色效果差别很大。商品甲基绿常混有甲基紫，影响染色效果，应先把药品放在分液漏斗中，加入足量的氯仿，用力振荡，然后静置，直到洗脱甲基紫为止，最后干燥备用。方法步骤及结果的比较一.核心步骤：Unna试剂染色5～30′染色前不做盐酸处理也可观察到正确的染色结果.二.辅助性步骤:(一).盐酸处理此步骤需处理得当才有高中教材中所述作用效果。若浓度过高、处理温度过高、时间过长，结果核不是呈蓝绿色，而是与细胞质一样呈红色。关于盐酸浓度：质量分数8%盐酸处理所得

7、结果体积分数8%盐酸处理所得结果(二)有些资料介绍染色后用丙酮短时间(多为30〞）处理有分色的效果方法与步骤实例(洋葱鳞茎内表皮)实验片：撕取小块洋葱鳞茎内表皮，置载玻片上。↓滴1~2滴95%酒精，处理10分钟↓滴2滴Unna试剂，染色15分钟↓吸去多余染液，滴加蒸溜水漂洗2次，吸去多余水分。↓盖上盖玻片，镜检。实验片：在洁净载玻片上滴一滴生理盐水，漱口,用消毒牙签刮取口腔上皮细胞,将附有材料的一端放在载片液滴中涂抹几下→点燃酒精灯，烘干。↓滴1~2滴95%酒精处理10分钟。↓滴1滴Unna试剂，染色10分钟

8、↓吸去多余染液，用清水洗净。↓盖上盖玻片，镜检。方法与步骤实例(人口腔上皮细胞)实验方法改进人口腔上皮细胞染色及观察将课本上“步骤二、水解”一步删除，以避免HCL带来的影响，这样细胞核能被染成绿色。推测HCL除了影响吡罗红甲基绿染色剂作用的pH值以外，还有可能作用于DNA使之变性而不能与甲基绿染料分子结合导致实验失败。洋葱磷叶表皮细胞染色及观察在洁净的载玻片上滴加8％的HCl一滴，将小块洋葱鳞叶表皮