香烟烟雾提取物对大鼠主动脉平滑肌细胞迁移的影响及其机制探讨

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1、香烟烟雾提取物对大鼠主动脉平滑肌细胞迁移的影响及其机制探讨【摘要】目的探讨香烟烟雾提取物（cigarettesmokeextract，CSE）对大鼠A10主动脉血管平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecell，VSMC）迁移的影响，并对其可能机制进行初步探讨。方法体外培养大鼠VSMC，并分为空白对照组及CSE组，其中CSE组给予5％CSE处理24小时，应用TransRNA及蛋白表达均较对照组明显升高（P＜0.01）。结论CSE能够促进大鼠VSMC的迁移，且其机制可能与上调OPN表达有关。血管重塑是动脉粥样硬化、高血压等血管相关疾病的共同病理生理过程，而血管平滑

2、肌细胞(vascularsmoothmusclecell，VSMC)向内膜下增殖与迁移是血管重塑的重要病理基础[1-3]。吸烟是动脉粥样硬化的重要危险因素之一，参与了血管重塑的发生发展过程，但其机制尚有待研究。骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是一种分泌型的糖基化磷蛋白，文献报道应用抗OPN抗体可以抑制VSMC的表型转化、迁移和增殖。本研究拟应用香烟烟雾提取物（cigarettesmokeextract，CSE）对大鼠VSMC进行处理，观察其对大鼠VSMC迁移的影响，并检测OPN表达水平的变化，从而明确CSE是否通过上调OPN从而促进VSMC的迁移，并进而对CSE参与

3、血管重塑的机制进行初步探讨。材料与方法一、材料1.细胞核试剂购自美国肯塔基大学烟草健康研究所生产的烟草研究用香烟（3R4F）。大鼠A10主动脉VSMC株购自美国ATCC细胞库。胎牛血清购自杭州四季青公司。RT-PCR逆转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。OPN兔抗大鼠多克隆抗体、α–tubulin兔抗大鼠多克隆抗体购自SantaCruz公司。Trans，5min，弃上清，无血清无抗生素DMEM1ml重悬细胞（5×105/ml）。将Transin，再用苏木素染色15min，置于1%盐酸酒精分化3s。自来水冲洗15min。将上室的滤膜过夜晾干，用刀片切下，在载玻片上滴加中性树胶

4、半滴，下室面朝上平铺于载玻片上，再滴半滴中性树胶于膜上，盖玻片封片保存。显微镜下照相并计数迁移到滤膜下室面的VSMC，每个样本计数5个高倍视野（×200）的穿膜细胞数，取平均值，测定VSMC迁移抑制率。4．RT-PCR法检测OPNmRNA的表达　反应条件如下：94℃5min；93℃变性30s，(OPN54℃，GAPDH56℃)退火30s，72℃延伸60s，共30个循环，最后72℃延伸10min。扩增结束后取5μlPCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析(120V，45min)，DNAgreen染色，凝胶自动成像分析系统扫描成像，以GAPDH为内参。OPN上游引物5’-GCTG

5、AAGCCTGACCCATCT-3’，下游引物5’-TCCCGTTGCTGTCCTGAT-3’；GAPDH上游引物5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。5．SF，0.lmmol/L，50mmol/LNaCI，1mmol/LEDTA，NaVO4，10mg/mlaprotinin，10mg/mlLeuPePtin）200μl裂解细胞，将蛋白浓度调至5μg/μl。以每孔50μg的含量加样，SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离。转膜于PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1h。加入（1:500稀释的OP

6、N兔抗大鼠多克隆抗体，α–tubulin兔抗大鼠多克隆抗体）4℃孵育过夜。TTBs洗膜5min×3，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2h，TTBS洗膜5min×2，TBs洗膜5min×l，加DAB液显色5-10min。凝胶成像分析系统成像。三、统计学处理　所有数据均用SPSS13.0软件进行统计学分析，不同组间参数比较用One-RNA表达的影响RT-PCR检测发现：CSE处理组OPNmRNA的表达较对照组明显升高（P＜0.01）（见图1）。三、CSE对VSMC中POPN蛋白表达的影响C的增殖和迁移以及细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）的沉积。其中，

7、血管中膜平滑肌细胞向内膜下迁移与增殖是血管重塑的主要病理基础之一。随着对吸烟与血管相关机制研究的深入，人们发现吸烟可促进VSMC增殖，有学者报道其可能与吸烟引起血管活性因子如结缔组织生长因子、内皮素、血管内皮生长因子等的大量释放有关[6,7]，其机制可能与MAPK、PKC等信号传导通路有关[8]。但目前国内外关于吸烟对VSMC迁移影响的相关研究尚少见。本研究通过应用TransRNA以及蛋白含量的变化，进而对CSE促进VSMC迁移的机制进行初步探讨。结果显示，CSE组OPNmRNA和蛋白水平的表达均较对照