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《monascus ruber 5031洛伐他汀合成酶基因的pcr分析论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、Monascusruber5031洛伐他汀合成酶基因的PCR分析论文【关键词】洛伐他汀合成酶合成酶摘要:目的分析Monascusruber5031洛伐他汀合成酶基因的结构。方法用3对以土曲霉洛伐他汀合成酶基因为基础设计的PCR引物对红曲霉基因组进行了PCR分析，其中一对引物序列为，正向：5’TTCGATGCGGCCTTCTTCAAT3’和反向5’ATGGTTCGGCATCGTAATTCC3’。结果在红曲霉基因组中相当于土曲霉洛伐他汀合成酶基因的LNKS区域扩增出了745bp的核酸片段，其序列与土曲霉合成酶的这一区域序列相同
2、。结论土曲霉和红曲霉洛伐他汀合成酶基因存在同源区域。关键词:红曲霉平；土曲霉；洛伐他汀合成酶合成酶；PCRAbstract:ObjectiveAnalysesthestructureofMonascusruber5031lovastatinbiosynthesisgenecluster.MethodsThreepairsofdegeneratePCRprimersatchingtheregionsoflovastatinbiosynthesisgeneclusterinAspergillusterreus,oneofthe
3、mis,5’primer:TTCGATGCGGCCTTCTTCAAT,3’primer:ATGGTTCGGCATCGTAATTCC.ResultsA745bpDNAsequenceplifiedbyPCRfromMonascusruber5031genomicDNAandthesequenceisthesameilarsequenceonacolinK）即洛伐他汀(lovastatin)，是胆固醇生物合成中的关键酶HMGCoA还原酶的竞争性抑制剂，是目前治疗高血脂症最有效的药物之一，并且对心绞痛患者和心肌梗死患者也有一定的
4、治疗效果［1］。此外，它还可下调炎症相关转录因子的表达,从而有益于治疗动脉粥样硬化症［2］。近期研究表明,它可促进恶性甲状腺细胞凋亡［3］.freelL，煮成稀粥，冷却到60~65℃。将150g麦芽粉掺入大米粥中搅拌均匀，放入55~60℃保温箱内糖化4h，取出过滤。取250mL加250mL水，加2%的琼脂，装瓶、灭菌。菌丝生长培养基：以上培养基不加琼脂。1.1.2仪器与试剂日立高速冷冻离心机。MonacolinK标准品，购自Sigma公司。PCR引物由上海生工合成。Taq酶采用上海生工的TaqPlus。上海生工的胶回收试剂
5、盒UNIQ-10。TaKaRa公司的pMD-18T克隆载体。1.2方法1.2.1培养方法用2mL无菌水冲洗孢子，接入固体斜面培养。固体斜面培养7d后，以5mL水洗下，稀释至浓度为107个/mL，取2mL加入100mL菌丝生长培养基，培养温度28℃，转速150r/min。培养4d。1.2.2红曲基因组DNA的提取根据文献［9］的方法改进而成。取1g菌丝，液氮中磨成粉状，加入5mL2×CTAB缓冲液［100mmol/LtrisCl(pH8.0),20mmol/LEDTA,1.4mol/LNaCl,2%(ρ)CTAB,2%(ρ)
6、β巯基乙醇］，58℃1h，冷至室温后加入等体积氯仿异戊醇（24∶1）抽提，10000g离心10min，取上清，加入0.1倍体积10%CTAB0.7mol/LNaCl溶液，温和摇动，再加入等体积氯仿异戊醇（24∶1）抽提，10000g离心10min，取上清，加入2/3体积预冷异丙醇沉淀DNA，1000g离心15min，沉淀溶于100μLTE中，加入RnaseA至终质量浓度100μg/mL，37℃作用2h，加入等体积酚氯仿（1∶1）抽提，10000g离心10min，上清中加入2倍体积无水乙醇沉淀DNA，沉淀用70%乙醇洗1遍，
7、风干，溶于TE，4℃保存。1.2.3PCR引物的设计3对PCR引物的设计详见表1。表1PCR引物的设计（略）第1组引物是参照Thomas等［10］针对土曲霉的lovB基因的KS功能域序列设计的引物设计的。1.2.4PCR反应①反应体系：200μmol/LdNTPs,1UTaq酶，2.625mmol/LMgCl2,2μmol/LMgSO4,10mmol/LKCl,.freelmol/L(NH4)2SO4,20mmol/LTrisHCl(pH8.75),0.1%Tritonx100,0.1mg/mLBSA,模板40ng（基因组
8、DNA和cDNA）,引物60ng，总反应体积20μL。②热循环条件：94℃预变性5min，之后以94℃1min，50℃1min，72℃2min程序45个循环，延伸72℃10min。1.2.5lovB扩增片段的克隆与测序回收及克隆红曲的lovB引物扩增产物中约750bp的片段，其中连接反应液成分为pMD1
