基因表达沉默技术

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1、药学系药物基因组学教研室2010.06.18基因表达沉默技术1教学内容及要求1234反义核酸技术核酶技术基因敲除技术RNA干扰技术重点熟悉2参考资料《基因工程及其分子生物学基础-基因工程分册》，北京大学出版社，静国忠编自备材料（个人实践经验）3第一节RNA干扰技术4基本概念掌握RNA干扰(RNAinterference,RNAi):由小双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。小干扰RNA:具有干扰功能的这种短双链RNA就称为小干扰RNA（SmallinterferingRNA,siRNA)。5注射sense秀丽线虫antisense

2、注射1995年．．．．．．发现历史6反义RNA(antisenseRNA)对基因抑制效应比较微弱；而双链RNA（dsRNA）能够高效特异性阻断靶基因的表达。animportantfinding！．．．．．．1998年7CraigC.Mello克雷格·梅洛AndrewZ.Fire安德鲁·菲尔2006NobelPrizeinPhysiologyorMedicine8随后陆续发现RNAi也存在于水稻、烟草、果蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。RNAi现象的普遍性9靶RNAi机制siRNA在ATP参与下形成RISC复合体，被RNA解旋酶解旋成单链，并

3、由其中的反义链指导移至靶mRNA，靶mRNA被切割后诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。外源长dsRNA在ATP作用下被RNaseⅢDicer切割成21nt左右、由正义和反义链组成的siRNA重点10siRNA19bpduplex2nt3’overhangs21ntsiRNA实验设计难点111）靶序列的调出http://www.ncbi.nlm.nih.govNationalCenterforBiotechnologyInformation1213142）利用免费设计软件进行siRNA设计InvitrogenTakaraOligoegin

4、e15软件的选择原则1、选择可读框内、翻译起始位点之后50～100nt的序列作为靶序列；2、选择的靶位5’端之前的两个碱基为AA；3、GC含量控制在35%～65%,最好50%左右；4、碱基数目控制在19～21nt；5、避免连续3个或3个以上的相同碱基；6、避免重复序列或回文结构以免形成发夹状结构；7、靶序列同数据库进行BLAST同源性比对。16我用的软件：siDirect173）siRNA合成或表达RNA聚合酶Ⅲ启动子（包括U6或H1）：转录起始点明确；转录生成小RNA；转录产物无polyA尾；转录终止为5个连续的U。181920213mg/m

5、l正向引物1μl3mg/ml反向引物1μl90°C4min70°C10min室温订购合成的引物序列退火224)siRNAworking?23mRNA:Real-timePCRProtein:Westernblot17siRNAMock245)合成or构建载体？化学合成siRNA：瞬时转染实验花费高使用的时候，要用二乙基焦碳酸酯（DEPC）处理过的灭菌蒸馏水溶解，这是因为siRNA易被RNA酶降解。B.载体：为了长期观察基因沉默后的影响，需要长期表达siRNA。C.载体选择：易转染的细胞用质粒载体，难转染的细胞用逆转录载体或慢病毒载体。256）体

6、外导入细胞a.脂质体转染：＋＋＋＋＋－－－－－－＋具体操作步骤：按照脂质体说明书进行26b.电穿孔导入：27c.病毒感染（以腺病毒为例）：28next29第二节反义核酸技术301978年，Stephenson和Zamecnik首次报道了反义寡脱氧核苷酸可抑制劳斯肉瘤病毒RSV的复制现象。1984年，Izantweintraub提出了“反义核酸技术”的概念。InhibitionofRoussarcomaviralRNAtranslationbyaspecificoligodeoxyribonucleotide.ProcNatlAcadSciUSA

7、,1978;75:285-288.历史由来31反义寡核苷酸概念：正义链互补的一段核苷酸序列，包括反义DNA和反义RNA。基本概念反义RNA技术反义DNA技术32反义抑制的主要机理直接作用于靶mRNA的SD序列或部分编码区，直接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶H降解。反义核酸mRNARNaseH33论著超过１６０００篇。基因功能研究（1994年流行）如抗病毒或抗肿瘤基因治疗研究等领域。反义核酸应用341998年8月27日，美国食品药品管理局（FDA）正式批准了由ISIS公司开发的全球第一个反义药物“Vitravene”

8、（福米韦生，fomivirsen）在美国上市。该药抗病毒作用较强，是更昔洛韦的1000倍，用于治疗巨细胞病毒性视网膜炎和艾滋病人并发巨细胞视网膜炎,有