基因表达沉默技术

基因表达沉默技术

ID:25210409

大小:3.09 MB

页数:62页

时间:2018-11-18

基因表达沉默技术_第1页
基因表达沉默技术_第2页
基因表达沉默技术_第3页
基因表达沉默技术_第4页
基因表达沉默技术_第5页
资源描述:

《基因表达沉默技术》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在教育资源-天天文库

1、药学系药物基因组学教研室2010.06.18基因表达沉默技术1教学内容及要求1234反义核酸技术核酶技术基因敲除技术RNA干扰技术重点熟悉2参考资料《基因工程及其分子生物学基础-基因工程分册》,北京大学出版社,静国忠编自备材料(个人实践经验)3第一节RNA干扰技术4基本概念掌握RNA干扰(RNAinterference,RNAi):由小双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。小干扰RNA:具有干扰功能的这种短双链RNA就称为小干扰RNA(SmallinterferingRNA,siRNA)。5注射sense秀丽线虫antisense

2、注射1995年......发现历史6反义RNA(antisenseRNA)对基因抑制效应比较微弱;而双链RNA(dsRNA)能够高效特异性阻断靶基因的表达。animportantfinding!......1998年7CraigC.Mello克雷格·梅洛AndrewZ.Fire安德鲁·菲尔2006NobelPrizeinPhysiologyorMedicine8随后陆续发现RNAi也存在于水稻、烟草、果蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。RNAi现象的普遍性9靶RNAi机制siRNA在ATP参与下形成RISC复合体,被RNA解旋酶解旋成单链,并

3、由其中的反义链指导移至靶mRNA,靶mRNA被切割后诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。外源长dsRNA在ATP作用下被RNaseⅢDicer切割成21nt左右、由正义和反义链组成的siRNA重点10siRNA19bpduplex2nt3’overhangs21ntsiRNA实验设计难点111)靶序列的调出http://www.ncbi.nlm.nih.govNationalCenterfor BiotechnologyInformation1213142)利用免费设计软件进行siRNA设计InvitrogenTakaraOligoegin

4、e15软件的选择原则1、选择可读框内、翻译起始位点之后50~100nt的序列作为靶序列;2、选择的靶位5’端之前的两个碱基为AA;3、GC含量控制在35%~65%,最好50%左右;4、碱基数目控制在19~21nt;5、避免连续3个或3个以上的相同碱基;6、避免重复序列或回文结构以免形成发夹状结构;7、靶序列同数据库进行BLAST同源性比对。16我用的软件:siDirect173)siRNA合成或表达RNA聚合酶Ⅲ启动子(包括U6或H1):转录起始点明确;转录生成小RNA;转录产物无polyA尾;转录终止为5个连续的U。181920213mg/m

5、l正向引物1μl3mg/ml反向引物1μl90°C4min70°C10min室温订购合成的引物序列退火224)siRNAworking?23mRNA:Real-timePCRProtein:Westernblot17siRNAMock245)合成or构建载体?化学合成siRNA:瞬时转染实验花费高使用的时候,要用二乙基焦碳酸酯(DEPC)处理过的灭菌蒸馏水溶解,这是因为siRNA易被RNA酶降解。B.载体:为了长期观察基因沉默后的影响,需要长期表达siRNA。C.载体选择:易转染的细胞用质粒载体,难转染的细胞用逆转录载体或慢病毒载体。256)体

6、外导入细胞a.脂质体转染:+++++------+具体操作步骤:按照脂质体说明书进行26b.电穿孔导入:27c.病毒感染(以腺病毒为例):28next29第二节反义核酸技术301978年,Stephenson和Zamecnik首次报道了反义寡脱氧核苷酸可抑制劳斯肉瘤病毒RSV的复制现象。1984年,Izantweintraub提出了“反义核酸技术”的概念。InhibitionofRoussarcomaviralRNAtranslationbyaspecificoligodeoxyribonucleotide.ProcNatlAcadSciUSA

7、,1978;75:285-288.历史由来31反义寡核苷酸概念:正义链互补的一段核苷酸序列,包括反义DNA和反义RNA。基本概念反义RNA技术反义DNA技术32反义抑制的主要机理直接作用于靶mRNA的SD序列或部分编码区,直接抑制翻译,或与靶mRNA结合形成双链RNA,从而易被RNA酶H降解。反义核酸mRNARNaseH33论著超过16000篇。基因功能研究(1994年流行)如抗病毒或抗肿瘤基因治疗研究等领域。反义核酸应用341998年8月27日,美国食品药品管理局(FDA)正式批准了由ISIS公司开发的全球第一个反义药物“Vitravene”

8、(福米韦生,fomivirsen)在美国上市。该药抗病毒作用较强,是更昔洛韦的1000倍,用于治疗巨细胞病毒性视网膜炎和艾滋病人并发巨细胞视网膜炎,有

当前文档最多预览五页,下载文档查看全文

此文档下载收益归作者所有

当前文档最多预览五页,下载文档查看全文
温馨提示:
1. 部分包含数学公式或PPT动画的文件,查看预览时可能会显示错乱或异常,文件下载后无此问题,请放心下载。
2. 本文档由用户上传,版权归属用户,天天文库负责整理代发布。如果您对本文档版权有争议请及时联系客服。
3. 下载前请仔细阅读文档内容,确认文档内容符合您的需求后进行下载,若出现内容与标题不符可向本站投诉处理。
4. 下载文档时可能由于网络波动等原因无法下载或下载错误,付费完成后未能成功下载的用户请联系客服处理。