hbv全基因组克隆转染细胞系的建立论文

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1、HBV全基因组克隆转染细胞系的建立论文赵艳芳,闫永平,苏海霞,王安辉,张磊,张景霞,门可,徐德忠【关键词】肝炎病毒,乙型;基因组,病毒;克隆,分子;转染;细胞培养;基因表达【Abstract】AIM:ToconstructaneforproducingHBVinvitro.METHODS:FulllengthHBVDNAedpcDNA33HBV).HepG2cellsmunocytochemicalstaining.SgenemRNAexpressionidpcDNA33HBVainlyinthecytoplasm.SgenemRNA

2、expressionecanreach1×108copies/LdetectedbyrealtimequantitativePCR.CONCLUSION:RebinantplasmidpcDNA33HBVcouldbeexpressed,transcribedandreplicatedinHepG2cells.ThistransfectionbasedcellculturesystemcouldproducehighcopiesofHBVgenome.【Keye,viral;cloning,moleculor;transfection

3、;cellculture;geneexpression【摘要】目的:建立HBV体外细胞培养体系.方法:构建HBV全基因克隆质粒pcDNA33HBV.freelRNA的表达,PCR检测细胞上清液DNA.结果:成功构建了HBV全基因克隆质粒pcDNA33HBV,稳定转染HepG2后,培养上清HBsAg,HBeAg阳性,细胞内HBcAg呈核浆型分布,且以浆型分布为主.RTPCR证实有HBVS基因mRNA的表达,上清中HBVS及前S基因阳性,荧光定量PCR检测显示培养上清中HBV滴度达1×108拷贝/L.结论:重组质粒pcDNA33HBV能在

4、HepG2细胞中表达、转录、复制,该细胞培养体系能产生较高水平的HBV.【关键词】肝炎病毒,乙型;基因组,病毒;克隆,分子;转染;细胞培养;基因表达0引言由于HBV宿主范围窄、动物模型缺乏,体外组织培养也一直没有太大进展,且不能在体外人工培养,制约了对HBV的研究[1].将HBVDNA转移至靶细胞,建立表达HBV的体外培养细胞模型对研究HBV生物学特性和肝炎发病机制有重要意义[2-4].HBV基因组呈双链闭合环状,基因结构紧凑,其开放读框分布于全长DNA,为使完整的转染基因能在细胞内复制,目的基因的长度要大于一个HBVDNA单元[5-

5、6].我们构建3倍HBV基因的重组真核表达质粒,转染细胞,以筛选获得稳定表达病毒蛋白的细胞模型,并研究其产生HBV的水平.1材料和方法1.1材料HBV全基因亚克隆载体pUC193HBV为pUC19在EcoRⅠ及HindⅢ位点中插入头尾相连的HBV(adr亚型)三连体,由山东大学医学院免疫学研究所张秋博士惠赠,保存在大肠杆菌DH5α中.真核细胞表达载体pcDNA3由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室赵晶博士惠赠;人肝母细胞瘤细胞系(HepG2)由第四军医大学微生物学教研室惠赠,本室传代培养;内切酶EcoRⅠ,HindⅢ,T4DNA连

6、接酶,TaqDNA聚合酶,反转录酶及DNAmarker(TakaRa公司);质粒提取试剂盒(西安市莱博科技发展有限公司);LipofectamineTM2000(Invitrogen公司);DMEM培养基,G418(Gibco公司);新生小牛血清(杭州四季青生物制品有限公司);ELISA检测试剂盒(上海科华生物工程股份有限公司);SABC免疫组化试剂盒,DAB染色剂(武汉博士德生物工程有限公司);S基因,βactin及HBV前S/S基因引物均由北京赛百胜公司合成.1.2方法1.2.1pUC193HBV和pcDNA3的酶切鉴定及目的基因

7、片段的获得过夜培养pUC193HBV和pcDNA3,以质粒提取试剂盒抽提制备pUC193HBV和pcDNA3,分别以EcoRⅠ,HindⅢ单酶切pUC193HBV,以EcoRⅠ,.freelg/LG418培养基进行筛选.设未转染的HepG2细胞为对照.待对照组细胞全部死亡后,用含300mg/LG418的培养基维持.筛选过程不含其他抗生素.1.2.4ELISA测抗原表达取转染细胞的上清液用ELISA法测HBsAg,HBeAg.操作及结果判定按ELISA试剂盒说明书进行,终止反应后10min内用酶标仪检测A450nm值.1.2.5SABC

8、染色法检测细胞中HBcAg的表达TritonX100处理,封闭非特异性抗原反应,依次加入一抗(兔抗人HBcmAb)、生物素化的二抗(羊抗兔IgG)和SABC复合物,DAB显色,脱水透明,封片观察.1.2.6RTPCR检测

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