维持性血透患者血清体外诱导血管新生

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1、维持性血透患者血清体外诱导血管新生【摘要】目的：探讨维持性血液透析患者血清在体外诱导血管新生及其机制.方法：人脐静脉内皮细胞分别培养于100mL/L透析患者血清培养基（实验组）和100mL/L健康人血清培养基（对照组）.倒置显微镜下观察血管样结构形成，MTT法检测细胞增殖，Trans2，MTT平均吸光度值1.073±0.046,细胞小室平均迁移细胞数63.5±6.2，均高于对照组.实验组细胞培养10hpp38表达及30h细胞内活性氧产生均明显增加.结论：维持性血透患者血清能够在体外诱导血管新生，pp38,ROS表达增加可

2、能是这种作用的细胞内机制.【关键词】血管生成血管内皮细胞血液透析p38活性氧　　0引言　　近年来研究证实，无论何种病因，人类多种急慢性肾损害均伴有微血管系统丧失或过度新生，并且提出了调控血管新生改善肾病进展的治疗概念.在透析患者中，血管新生也有相关报道.Sakkas等［1］对12例血液透析患者的腓肠肌进行病理活检发现血管密度与肌纤维组织的比例增加，Serradell等报道血液透析患者血管病变早期有内皮细胞的增生，并且可能是血管早期病变的主要形式［2］.血管新生是血管系统一种重要的代偿性变化，可能与血液透析患者血管系统并发症相

3、关.但血液透析患者血管新生机制尚不清楚，本文在体外细胞培养的水平研究维持性血液透析患者血清能否诱导血管新生，并且对其形成机制进行初步探讨.　　1对象和方法　　1.1对象选取199609/200610我院11例维持性血液透析患者及10例健康志愿者，所有对象均签署知情同意书.血液透析患者平均年龄（63.2±4.4）岁，原发病为慢性肾炎、高血压肾病和多囊肾等.所有患者均用碳酸盐透析，每周透析3次，每次4.5h.采用聚砜膜F7型透析器.健康对照组平均年龄（58.3±5.1）岁，均为建康志愿者.两组的年龄、性别组成无统计学差别.透

4、析患者在透析后2h动脉端采血，正常对照组清晨空腹采血，取血后立即低温离心（4000r/min，20min），取上层血清-70℃保存备用.　　1.2方法　　1.2.1内皮细胞培养及实验分组人脐静脉内皮细胞（HUVEC）由重庆医科大学组胚教研室惠赠，内皮细胞常规培养于含100mL/L胎牛血清（杭州四季青）的RPMI1640培养基（Gibco），置于37℃50mL/LCO2培养箱中孵育.细胞分为实验组和对照组，实验组用含100mL/L透析患者血清的RPMI1640培养基，对照组用含100mL/L健康人血清的RPMI1640培养基.

5、　　1.2.2血管样结构形成实验把HUVECs接种于24孔培养板，经上述干预10,20,30h，200倍光学显微镜下每孔随机选择10个视野计数形成血管样结构的数目及面积（ImageProPlus5.1图像分析软件），结果取均值.　　1.2.3四甲基偶氮唑蓝比色（MTT）法检测细胞增殖HUVECs分别在实验组和对照组培养基中以2×106/L密度接种于96孔培养板，每孔总体积200μL，置于37℃50mL/LCO2培养箱中孵育，分别在10,20,30h后，每孔加入MTT（Sigma）溶液（5g/L）20μL，继续孵育4h，弃上

6、清，每孔加入二甲亚砜（Sigma）150μL，室温震荡10min，在波长570nm处用酶标仪测量吸光度A值.每组、每个检测点设6个复孔，重复2次，结果取均值.　　1.2.4TransL/L基质胶的RPMI1640培养基，HUVECs分别在实验组和对照组培养基中以5×108/L密度种于小室内，总体积0.4mL，再把小室放入24孔培养板孔内，每孔再加入相同培养基0.6mL，培养30h后用40g/L多聚甲醛固定细胞，擦净滤膜内表面细胞，HE染色，400倍光学显微镜下随机选择10个视野，计数每个视野细胞数目，结果取均值.以迁移细胞数

7、目表示细胞的迁徙能力.　　1.2.5比色法检测细胞内活性氧把HUVECs以2×107/L密度接种于48孔培养板，经前述培养及分组干预10,30h后，弃上清，每孔加入200μL蒸馏水，冰上吹打直至细胞溶解.每孔的200μL细胞裂解液按活性氧测定试剂盒（南京凯基生物）说明书检测.最后计算各孔细胞产生活性氧能力.每组、每个检测点设6个复孔，实验重复2次，结果取均值.　　1.2.6L培养瓶，经前述培养及分组干预10h后用PBS洗2次，加入细胞裂解液冰上吹打30min，然后4℃12000g离心30min，取上清用BAC法进行蛋白定量.

8、制备100g/LSDSPAGE凝胶，蛋白加样量40μL，100V电压电泳2h分离蛋白，然后用电印迹系统（20mA，15h）把蛋白转到PVDF膜上.转有蛋白的膜先用血清37℃封闭1h，然后用pp381∶300稀释的一抗（SantaCruz）37℃孵育2h，再用1∶1000稀释的相应二抗3