聚己内酯电纺纤维支架材料对骨髓基质细胞增殖及分化的影响

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1、聚己内酯电纺纤维支架材料对骨髓基质细胞增殖及分化的影响【摘要】目的：观察聚己内酯（PCL）电纺纤维支架材料对骨髓基质细胞(BMSCs)增殖及分化特点的影响，评价其作为骨组织工程的支架材料的应用前景.方法:将兔BMSCs与PCL电纺纤维支架材料在培养板内共培养.采用形态学观察、MTT法及ALP检测等方法检测BMSCs在PCL电纺纤维表面的粘附、增殖和分化能力.结果:体外培养的BMSCs能在PCL电纺纤维表面正常粘附和增殖，并且表达较高的碱性磷酸酶活性.结论:PCL电纺纤维适合作为支架材料应用于BMSCs为种子细胞的组织构建.【关键词】电纺纤维;聚己内酯;骨髓基质细胞　　0引言　　理想

2、的组织工程支架材料要求其不但能够作为种子细胞体内扩增和增殖的支架，而且应当能够成为生长因子、生物活性物质和基因的生物载体，发挥细胞功能调节的作用［1］.目前已有近百种聚合物成功的通过这一技术获取了超细纤维并被陆续应用于膜技术、增强材料、纺织品、光学传感器、医药释放体系以及组织工程支架材料制备等诸多领域［2］.本研究旨在通过聚己内酯（polycaprolactone,PCL）电纺纤维支架材料对兔骨髓基质细胞（bonemarroalcells,BMSCs）生长、增殖和功能分化作用的研究，初步探讨PCL电纺纤维作为组织工程支架材料的应用前景.　　1材料和方法　　1．1材料聚己内酯（PCL

3、，美国Sigma公司，Mn=80000）；二甲基甲酰胺（DMF，西安化学试剂公司）；氯仿（西安化学试剂公司）；BGG40/2高压直流电源(北京机电研究所，030KV)；JSM6700F型扫描电镜(日本JEOL公司)；BX60型荧光显微镜(日本Olympus公司)；酶联免疫检测仪（美国BioTek公司）；1.5mo龄新西兰幼兔1只，雄性，体质量1.5kg(第四军医大学实验动物中心)；DMEM培养液（美国GibcoBRL公司）；胎牛血清（浙江金华清湖犊牛利用研究所）；胰蛋白酶（上海浦东生化试剂厂）；MTT（美国Sigma公司）；PholloidinFITC（美国Sigma公司）

4、；碱性磷酸酶(alkalinePhosphatase，ALP)检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）.　　1.2方法　　1.2.1PCL电纺纤维支架的制备以氯仿/DMF（体积比2∶1）的混合溶液为溶剂，配制浓度为80g/L的PCL电纺丝溶液.将电纺丝溶液加入一个安装有8号不锈钢注射针头的自制玻璃加样管.针头即喷丝口与BGG40/2高压直流电源的正极相连，针头下方安装一个接地的铜板，上覆铝箔作为纤维的接收屏与高压直流电源的负极相连.在外加电压10kV，接收距离12cm，电纺丝溶液流量为3mL/h的条件下进行静电纺丝.收集接收屏表面获得的纵横交错的无纺纤维毡，置于干燥器中干燥保存.　　1

5、.2.2兔BMSCs的原代培养与接种取新西兰幼兔四肢长骨，纵行剖开，DMEM培养液冲洗骨髓腔，静置后取上清进行培养BMSCs.24h后换液，去除未贴壁的血细胞.每3d换液1次，2.5g/L胰酶常规消化传代，倒置显微镜下观察.取第二代生长良好的BMSCs，胰酶消化传代.实验分组为PCL电纺纤维实验组和细胞培养板对照组两组.将传代培养的第二代BMSCs以4×104/cm2浓度接种于各组，每孔加入500μL接种细胞液，置入细胞培养箱4h，再加入500μL培养液，50mL/LCO2,饱和湿度、37℃继续培养.　　1.2.3肌动蛋白actin直接免疫荧光染色培养8h后取出PCL电纺纤维试件，

6、PBS冲洗3遍.37mL/L甲醛的PBS溶液固定5min,PBS洗涤2遍.丙酮脱水，1mL/LTritonX100渗透5min.10mg/LPholloidinFITC37℃孵育染色40min，抗荧光淬灭液封片.于365nm荧光显微镜下观察记录.　　1.2.4扫描电镜观察于培养3d后取出PCL电纺纤维试件，PBS冲洗3遍，25mL/L戊二醛固定24h.乙腈梯度脱水，10g/L锇酸处理1h，临界点干燥，离子溅射仪喷金.导电胶固定，以冷场发射扫描电子显微镜观察，电子加速率为5kV.　　1.2.5MTT检测于培养1，3，5，7d后向实验各组分别加入2.5g/L胰蛋白酶消化3min，然

7、后加入含100mL/L胎牛血清的DMEM终止消化.500g离心10min，每管重新加入DMEM培养液200μL，接种至96孔培养板.每组4孔，每孔加入5g/L的MTT溶液20μL，37℃孵育4h.在酶联免疫检测仪上测各孔A490nm值，每组3个试件.　　1.2.6ALP活性检测培养的第3，7,14日后，向实验各组分别加入2.5g/L胰蛋白酶消化3min，然后加入含100mL/L胎牛血清的DMEM终止消化.将每个样本的细胞悬液加入离心管，500g离心10min.每管加入