补肾生精法对老龄大鼠睾丸蛋白表达谱的影响论文

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1、补肾生精法对老龄大鼠睾丸蛋白表达谱的影响论文陈通文曾金雄王海鹰黄锦燕【摘要】【目的】观察补肾生精法对老龄大鼠睾丸蛋白表达谱的影响。【方法】选用20只22月龄老龄雄性SD大鼠随机分为2组，每组10只，分别为空白对照组和补肾生精组；补肾生精组给药剂量为0.05g·kg-1·d-1，连续灌胃给药60d。取大鼠右侧睾丸，采用双向凝胶电泳法分析空白对照组和补肾生精组大鼠睾丸差异表达蛋白。【结果】与空白对照组比较，补肾生精组大鼠睾丸中有7种蛋白表达发生了显著变化，其中4种蛋白表达上调，3种下调。对7种差异表达蛋白点胶内酶切后进行质谱分析

2、.freelinebindingprotein,PEBP）、热休克蛋白8(heatshock70kDaprotein8，HSP7C)、磷酸丙糖异构酶(triosephosphateisomerase，TPIS)、3磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde3phosphatedehydrogenase，GAPDH）、谷胱苷肽S基转移酶1（glutathioneStransferaseMu1，GSTM11）。【结论】补肾生精法延缓衰老的作用可能与其能调节老龄大鼠睾丸蛋白表达有关。【关键词】补肾生精法/治疗

3、应用；衰老/中药疗法；蛋白质组；疾病模型，动物；大鼠睾丸功能的减退与男性衰老之间存在着重要的联系。近来多项研究表明，从50岁开始，随着年龄的增长，男性由于睾丸雄激素合成功能逐步衰退而引起一系列的临床综合征称为中老年男性部分雄性激素缺乏综合征（PADAM）［1］。中医学认为肾虚是衰老的主要原因，现代研究也证明肾虚与衰老密切相关，补肾方药确有延缓衰老作用［2-3］。为了探讨补肾生精方药延缓衰老的机理，我们应用蛋白质组学技术，观察了补肾生精颗粒对老龄大鼠睾丸蛋白表达谱的影响。现报道如下。1材料与方法1.1主要试剂与仪器固相pH梯度

4、(immobilinepHgradient,IPG)胶条、尿素、硫脲、二硫苏糖醇(DTT)、甘油、蛋白质相对分子量标记、3［3（胆酰胺丙基）二甲氨基］丙磺酸内盐（CHAPS）、胶条缓冲液(IPGbuffer)、凝胶条覆盖液、胶槽清洗液、过硫酸胺(APS),十二烷基磺酸钠(SDS）均购自Amershambiotech公司;复合蛋白酶抑制剂(proteaseinhibitorcocktail）购自Pierce公司；碘乙酞胺、体积分数37%甲醛溶液、三氟乙酸（FA)、乙腈(A)均购自Sigma公司;胰蛋白酶购自Promega公

5、司；低熔点琼脂糖、硫代硫酸钠、牛血清白蛋白(BSA)均购自上海生工公司;乙酸、无水乙醇、甲醇、硝酸银、无水碳酸钠、乙二胺四乙酸钠(EDTANa+)、考马氏亮蓝R250、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸均为国产分析纯。等电聚焦系统（IPGphor）、GS800凝胶成像仪、ImageMaster2Dplatinumsoftg/L混悬液，灭菌后4℃保存备用。1.3动物及分组选用22月龄老年雄性SD大鼠20只（购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，合格证号：医动字06493），随机分为2组，每组各10只，分别为空白对

6、照组（灌喂等容积生理盐水）和补肾生精组（给药剂量为0.05g·kg-1·d-1），连续给药2个月。1.4蛋白抽提与定量以30g/L戊巴比妥20mg/kg腹腔注射麻醉动物；取大鼠右侧睾丸，剥去白膜，迅速置于液氮中，研碎；加入适量蛋白抽提试剂［8mol/L尿素、0.2g/LCHAPS、20mmol/LDTT、1mmol/LEDTA，1mmol/L苯甲基磺酸氟（PMSF）以及蛋白酶抑制剂混合物］；震荡溶解后，室温孵育1h，离心(4℃、12000g)15min，取上清，分装保存于-70℃冰箱；蛋白定量采用Bradford法。1.5双

7、向电泳选取pH值为3～10的线性IPG胶条，采用IPGphorSystem进行第一向等电聚焦。取1mg蛋白，溶于重泡胀液(8mol/L尿素、0.2g/LCHAPS、0.02mol/LDTT、0.5g/LIPG缓冲液)；将聚焦后的胶条在SDS平衡液(6mol/L尿素，20g/LSDS，1.5mol/LTrisHCl、pH8.8，体积分数30%甘油)中平衡2次(摇床上振荡)，每次15min。其中，第1次平衡液中加入20mmol/LDTT，第2次平衡液中加入100mmol/L碘乙酰胺；取出胶条在PROTENIIxiCell上进

8、行垂直方向的第二向电泳，即SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒流40mA，40min；置固定液(乙醇和乙酸的混合水溶液，含体积分数40%乙醇、10%乙酸)中固定30min；用1g/L考马斯亮蓝染液R250进行凝胶染色3h，脱色过夜。1.6图像分析采用凝胶成像仪扫描成二值图像格式（TIFF格式）