重组人tgf论文

《重组人tgf论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、重组人TGF论文【关键词】重组expression,purificationandidentificationofrebinanthumanTGFβ1fusionprotein【Abstract】AIM:Toclone,expressandpurifyhumantransforminggroanrhTGFβ1genefragmentidedintoE.coliDH5αandinducedtoexpressfusionproteinGSTrhTGFβ1olecularmassonoclonalantibo

2、dy.CONCLUSION:OursuccessfulcloningandexpressionofrhTGFβ1geneandpurificationofrhTGFβ1proteinlayabasisfortheproductionofrhTGFβ1autovaccine.【Keyinggroinggroarker（Fermentas公司）；抗hTGFβ1mAb（Invivogen公司）；羊抗小鼠二抗（华美生物工程有限公司）；碱性磷酸酶显色试剂盒、反转录试剂盒（Promega公司）；Trizol试剂盒（

3、GibcoBRL公司）；4℃高速离心机（Beckman公司）；蛋白质层析设备（AmersharmPharmaciaBiotech公司）.1.2方法1.2.1外周血单个核细胞的分离、培养［4］及总RNA的提取分离外周血单个核细胞按常规方法进行；细胞总mRNA的提取按GibcoBRL公司的Trizol试剂盒说明书进行,用紫外分光核酸蛋白分析仪测定RNA浓度和纯度.-70℃保存RNA备用.1.2.2RTPCR及PCR扩增目标序列以人外周血单个核细胞总mRNA为模板，根据Genbank提供的hTGFβ1基因序列

4、设计特异引物1和引物2进行RTPCR，按Promega产品说明书操作.引物1：5′GCGAATTCGCTCTGGACACCAACTATTGC3′(下划线部分为EcoRI酶切位点);引物2：5′GGTCGACTCAAGAGCACTTGCAGGAGCGCA3′(下划线部分为SalI酶切位点).以所制备hTGFβ1cDNA为模板，再进行PCR反应，扩增用于插入pGEX4T1表达载体的hTGFβ1DNA片段.反应条件为：94℃变性60s，55℃退火30s，72℃延伸60s.共进行30个循环.1.2.3大肠杆菌表

5、达载体的构建及诱导表达PCR反应完毕后，以15g/L琼脂糖电泳鉴定PCR产物.回收约350bp的DNA片段，用EcoRI和SalI双酶切后插入表达质粒pGEX4T1相应酶切点中转化E.coliDH5α感受态菌株.挑取重组菌落培养后提取质粒DNA，用EcoRI和SalI双酶切鉴定重组子.后者再经DNA测序确定出序列正确的重组子，命名为pGEX4T1hTGFβ1.重组质粒pGEX4T1hTGFβ1转化感受态DH5α，挑单克隆37℃培养过夜后，次日按1∶100转接于LB/Amp+培养基中，继续37℃摇动培养至

6、对数生长中期，测A600nm为0.4~0.6时，加IPTG使终浓度达0.5mmol/L诱导表达4h,收集菌体，行SDSPAGE.1.2.4表达产物的纯化及r约为39×103处产生了一条新生GST融合蛋白，与预期结果相符合；而未诱导的则无相应蛋白条带出现（图3）.裂菌后经SDSPAGE分析，目的蛋白以包涵体的形式存在，上清中无目的蛋白.2.3融合蛋白的纯化及ishraL,DerynckR,MishraB.Transforminggrocellsandcancer［J］.Science,2005，310(5

7、745):68-71.［2］HeldinCH,MiyazonoK,tenDijkeP.TGFbetasignallingfromcellmembranetonucleusthroughSMADproteins［J］.Nature,1997，390(6659):465-471.［3］DerynckR，AkhurstRJ，BalmainA.TGFbetasignalingintumorsuppressionandcancerprogression［J］.NatureGe，2001，29(2):117-129

8、.［4］苏海川，张惠中，范清宇，等.肿瘤坏死因子凋亡相关配体基因的克隆和表达［J］.第四军医大学学报,2003，24(16):1482-1484.［5］DerynckR,JarrettJA,ChenEY,etal.HumantransforminggroentaryDNAsequenceandexpressioninnormalandtransformedcells［J］.Nature,1985，316(6030):701-705.［6］P