新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞的体外培养论文

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1、新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞的体外培养论文谢裕华易春智项晓伟刘建仁【摘要】目的建立新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞体外培养的方法。方法选用出生后24h内的SD大鼠，分离大鼠大脑皮质细胞，加入含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养，于倒置相差显微镜下观察细胞生长形态;取传代培养的第3代细胞，采用计数板计数法和四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞生长情况。结果从新生大鼠大脑皮质分离的细胞生长旺盛，星形胶质细胞形态典型，未见其他种类细胞生长。结论建立了一种简单易行的大鼠星形胶质细胞体外培养方法。【关键词】星形胶质细胞/病理学细胞培养体外的大鼠星形胶质细胞功能广泛，在神经系统发育、突

2、触传递、神经系统内环境的稳定和新陈代谢等中枢神经系统的多种正常生理活动.freelga公司);其他试剂均为国产分析纯。23232型CO2恒温培养箱(SheldonManufactruing.Inc，USA);3k15低温离心机(美国Sigma公司);DLCJIF超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司);MPS60倒置显微镜(LeikaDMIRB);超纯水系统(MILLPORE，SAS67120MOISHEMA，France);佳能A630数码相机;550型酶标仪(BIORAD公司)。1.3星形胶质细胞的原代培养取新生SD大鼠(生后24h内)，断颈处死后浸入体积分数75

3、%乙醇中消毒。以血管钳从后夹住颈部，用眼科剪从枕部向前依次分开头皮及颅骨，再用眼科镊依次剥离，剔除脑膜及血管。取大脑(剔除海马部分)置于DHanks液中，用镊子撕碎成糜状，眼科剪反复剪10min，用移液枪轻轻吹打20～30次，用1.25g/L的胰蛋白酶消化15min，然后以含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基终止消化，1000r/min离心10min去上清后重新加入含血清培养基，吹打均匀，将细胞悬液接种至底壁面积为25cm2的培养瓶中，接种密度为1×106个/cm2，置培养箱中，37℃、体积分数5%CO2饱和湿度条件下培养，第2天待细胞贴壁后换液1次并去除死细胞，以后

4、每2～3d换液1次，细胞长成致密单层后进行传代培养。1.4传代培养细胞生长了8～10d后,在显微镜下可见细胞长满瓶底90%。向每个培养瓶中加入1.25g/L的胰蛋白酶1mL消化3～4min，消化时在显微镜下密切观察,防止消化过度导致细胞死亡。待细胞脱壁后,用含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基终止消化。将细胞悬液移入10mL离心管中,以1000r/min离心10min去上清后重新加入含血清培养基，吹打均匀，将细胞悬液接种至底壁面积为25cm2的培养瓶中，接种密度为1×106个/cm2，置培养箱中，37℃、体积分数5%CO2饱和湿度条件下培养,每2～3d换液1次，待细胞长满

5、瓶底90%以上时再次进行传代培养。1.5细胞生长情况1.5.1计数板计数将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。吸出少许细胞悬液，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min。镜下观察，计算计数板4大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按公式计算：n细胞(个·mL-1)=n细胞总数/4×10000。镜下偶见由2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。1.5.2四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法取培养第3代细胞，制成单细胞悬液接种于96孔培养板，103～104/孔，每块板接种10孔，一共接种6块96孔

6、培养板，每孔培养基总量200μL，37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养;分别于第1、2、3、5、7天加入2mg/mL的MTT液(50μL/孔),继续培养3h，吸出孔内培养液后，加入二甲基亚砜(DMSO)液150μL/孔，将培养板置于微孔板振荡器上振荡10min，使结晶物溶解，酶标仪检测各孔吸光度(D)值(检测波长490nm)。记录结果，绘制细胞生长曲线。2结果2.1细胞形态倒置相差显微镜下活体观察见星形胶质细胞的分离纯化过程中细胞生长情况与国外文献报道一致4-5，星形胶质细胞生长良好，细胞贴壁后开始生长繁殖，胞体不断增大，突触不断增多，并且细胞之间形成广泛的联系。原代分离的大鼠

7、大脑皮层细胞在种植24h后，所有细胞均已贴壁，光晕明显。培养3～4d后，细胞数量增多。随着培养时间的延长，培养物中的星形胶质细胞的比例越来越大，而神经元、少突胶质细胞的比例越来越少。传代后的细胞贴壁更快，一般6h左右大部分贴壁，第2天可以看到细胞开始铺开生长(图1-a)，第3天细胞突起明显，第5天细胞突触相互接触，细胞生长呈倍数增长，细胞数量和体积增大，细胞之间有广泛的接触(图1-b、c)，第7～8天细胞生长达到高峰(图-d)，以后细胞生长在形态和数量上变化不大。3讨论星形胶质细