kdr sirna表达载体的构建和鉴定论文

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1、KDRsiRNA表达载体的构建和鉴定论文缪应业，刘家云，易静，苏明权，沈建军，郝晓柯【关键词】血管内皮生长因子受体2ConstructionandidentificationofsiRNAexpressionvectortargetingKDR【Abstract】AIM:ToconstructpSilencerTM3.1H1smallinferferingRNA（siRNA）expressionvectortargetinghumanKDRgeneandtoobserveitssilencingeffectinth

2、ePC3prostatecancercellline.METHODS:ThedesignedoligostargetingKDRHⅠandHindⅢdigestion.TherebimantvectorsedbyenzymedigestionanalysisandDNAsequencing.TherebimantvectorsofpSilencer3.1KDR1,pSilencer3.1KDR2andpSilencer3.1KDR3emediatedtransfectionintothePC3prostatecan

3、cercelllineetastasispotential.At72haftertransfection,theexpressionofKDRatthelevelsofmRNAandproteinedaftertheenzymedigestionanalysisandtheDNAsequencing.ThesiRNAexpressionvectorsofpSilencer3.1KDR1,pSilencer3.1KDR2andpSilencer3.1KDR3,osteffectiveinthe3RNAandprote

4、inofKDRat72haftertransfection.CONCLUSION:pSilencerTM3.1H1siRNAexpressionvectorstargetingKDRentofprostatecancer.【Keyallinterfering;PC3cellline【摘要】目的：构建针对血管内皮生长因子受体Ⅱ(VEGFR2),又称激酶功能区受体（KDR）的pSilencerTM3.1siRNA(smallinterferingRNA)表达载体，并在前列腺癌细胞PC3中观察其干扰效果.方法：设计针对K

5、DR基因编码区的寡核苷酸链，体外退火后克隆入经BamHⅠ,HindⅢ双酶切线性化的干扰载体pSilencerTM3.1H1neo中.freelRNA及蛋白水平的表达情况.结果：经酶切鉴定及DNA测序，重组质粒中已插入了目的基因片断.转染KDRsiRNA的前列腺癌细胞，72h后，而以pSilencer3.1KDR3的抑制KDRmRNA及蛋白表达效果最为有效，其抑制率约为55%.结论：成功构建了针对KDR的RNA干扰表达载体pSilencer3.1KDR1,pSilencer3.1KDR2和pSilencer3.1KD

6、R3,pSilencer3.1KDR3能有效抑制KDR在前列腺癌细胞中表达，为将其进一步应用于前列腺癌的治疗研究奠定了基础.【关键词】血管内皮生长因子受体2；RNA，小分子干扰；PC3细胞系0引言血管内皮生长因子受体Ⅱ(vascularendothelialgroainreceptor,KDR)，在血管内皮和部分肿瘤细胞上特异性表达，对于VEGF的信号转导及血管内皮生成起主导作用，在肿瘤发生、发展中起重要的调节作用.研究表明，人前列腺癌细胞中有VEGF和KDR表达，存在VEGFKDR自分泌途径，与前列腺癌细胞的生长

7、和转移密切相关［1-2］.RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指双链RNA介导的、序列特异的转录后基因沉默的过程，它作为新兴的基因阻断技术,目前已广泛应用于基因功能及基因治疗的相关研究.我们通过构建KDR基因特异性smallinterferingRNA(siRNA)表达载体，检测其对前列腺癌细胞系PC3中KDR基因的沉默作用，为将其进一步应用于前列腺癌的治疗研究奠定了基础.1材料和方法1.1材料pSilencerTM3.1H1neo质粒购自美国Ambion公司；KDR特异性DNA片断由北京赛百胜

8、公司合成；BamHⅠ,HindⅢ限制性内切酶，T4DNA连接酶，DNA酶Ⅰ，Taq酶购自大连宝生物公司；去内毒素质粒提取和反转录试剂盒购自美国Promega公司；RPMI1640培养基、RNA提取、Lipofectamine2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；PC3细胞株，DH5a菌种为本室保存；小鼠抗人KDR单克隆抗体购自RD公司；免疫印记所