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1、四妙勇安汤对缺氧人脐静脉内皮细胞的影响论文.freeliaoyongantangonhumanumbilicalveinendothelialcells(HUVECs)injuryinducedbyhypoxia.MethodsTheHUVECsalgroup,modelgroupandSimiaoyongantanggroup,andthehypoxiamodeleasuredbyMTTassay.ThetransudationofLDHinthemediumeasuredbybiochemistryandthepos
2、itiveexpressionofVEGFmunofuorescencechemistry.ResultsThelevelofLDHberofthecellsstainedbyVEGFincreasedinthetreatmentgroupofSimiaoyongantang.ConclutionSimiaoyongantanghasprotectiveeffectonhypoxiainjuredHUVECs,ayberelatedtoitseffectofincreasingthecellslivability,red
3、ucingtheinjuryinducedbyhypoxia,up-regulatingexpressionsofVEGFandpromotingangiogenesis.Keyiaoyongantang;hypoxia;humanumbilicalveinendothelialcells;angiogenesis自从Hockel等1提出了“治疗性血管生成”的概念后,以促血管生长因子诱导心脑血管组织新生血管形成,已成为治疗性血管新生研究中最为活跃的领域。组织缺血缺氧后首先受到影响的是内皮细胞,因此,对内皮细胞的研究成为了
4、研究缺血缺氧性疾病的重要手段。人脐静脉为体外获得内皮细胞的重要来源,故选用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为实验对象。现代药理研究表明,四妙勇安汤能够扩张血管,疏通及促进血液循环,使未闭塞的动脉及侧枝循环变粗、增多,已经广泛应用于治疗血栓闭塞性脉管炎。近年来研究表明,此方对心血管疾患疗效确切2。本实验从细胞活性、乳酸脱氢酶(LDH)漏出量、血管内皮生长因子(VEGF)生成量3个方面观察了四妙勇安汤对缺氧HUVEC的影响。1实验材料1.1试剂1640干粉(Gibco公司),明胶(Sigma公司),胎牛血清(杭州四季青公司)
5、,100U/mL青霉素、80?g/mL链霉素(华北制药),胰蛋白酶(Amersco公司),四乙酸乙二胺-二钠(disodiumedetate,EDTA),Earle液(河北医科大学),兔抗人Ⅷ因子相关抗原(bs-0332R,北京博奥森生物公司),VEGF(北京博奥森生物公司),异硫氢酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)标记山羊抗兔多克隆IgG(ZF-0311,北京中杉金桥),HUVEC(KG110,南京凯基生物公司),四甲基偶氮唑蓝(MTT,Amersco公司),二甲亚砜(DMSO,G
6、ibco公司),磷酸盐缓冲液(PBS,华瑞创新生物公司),LDH试剂盒(上海丰汇科技公司)。1.2主要仪器CO2培养箱(Thermo),倒置相差显微镜(Olympus),荧光显微镜(Olympus),微量振荡器(FUHUAZTT实验细胞接种于96孔板中,参照上述缺氧模型及实验分组分别建立96孔板中缺氧模型及进行实验分组。每组均设8个复孔。将MTT配成终浓度为0.5mg/mL的使用液。弃去96孔板中原培养液,各孔加入MTT使用液100?L,37℃、5%CO2培养箱中孵育1h。取出培养板倒置,弃去原MTT,加入DMSO100
7、?L,微量振荡器振荡15min。用酶标仪在测定波长492nm、参考波长620nm处测定各孔吸光度值4。2.5乳酸脱氢酶漏出量的检测每组设6个复孔。按试剂盒说明,收集各组细胞培养液2mL,1000r/min离心3min,提取上清液50?L,加入试剂盒自带试剂3000?L,混匀后置37℃,分别于30、60s时读取吸光度值。使用前用蒸馏水在340nm处调零。2.6免疫荧光法测定血管内皮生长因子生成量取出6孔板各孔中盖玻片,PBS轻轻冲洗3次,每次持续约1min,10%福尔马林固定液室温固定10min,PBS轻轻冲洗3次,每次持
8、续约1min,10%马血清70?L室温封闭非特异性抗体20min,加入一抗VEGF(兔抗人,1∶100稀释)70?L,37℃孵育1h,同时以PBS代替一抗作为对照组。PBS轻轻冲洗3次,每次持续约1min,加入FITC标记的二抗(羊抗兔IgG,1∶25稀释)70?L,37℃孵育30min。立即置于荧光显微镜下观察,绿
