液相色谱使用及维护相关知识

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1、液相色谱使用及维护相关知识HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成.有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、柱温控制器等。一、输液泵1.泵的构造及原理目前高效液相输液泵多用柱塞往复泵,一般都采用双泵补偿法。如图所示:泵1的缸体容量是泵2的两倍,两者的柱塞运动方向相反。泵1吸液时,泵2排液;泵1排液时,泵2吸取泵1输出量的1/2,这样往复运动,保证输液的连续性。2.泵的使用及维护注意事项泵使用时要注意:a.防止固体微粒进入泵体,泵的入口都连接有砂滤片(或棒),滤器要经常清洗或更换。b.流动

2、相不应含有任何腐蚀性物质,含有缓冲液的流动相不应保留在泵内,尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内,由于蒸发或泄漏,甚至只是由于溶液的静置,就可能析出盐的微细晶体,会增加泵头内的宝石活塞杆和活塞的磨损。c.泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完,否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环,最终产生漏液。d.流动相应该先脱气,以免在泵内产生气泡,影响流量的稳定性,如果有大量气泡,泵就无法正常工作。泵的一般故障排除:a.没有流动相流出,又无压力指示。原因可能是泵内有大量气体,这时可打开泄压阀,使泵

3、在较大流量(如3ml/min)下运转,将气泡排尽,也可用一个针筒在泵出口处帮助抽出气体。另一个可能原因是密封环磨损,需更换。   b.压力和流量不稳。原因可能是气泡,需要排除;或者是单向阀内有异物,可卸下单向阀,浸入丙酮内超声清洗。有时可能是砂滤棒内有气泡,或被盐的微细晶粒或滋生的微生物部分堵塞,这时,可卸下砂滤棒浸入流动相内超声除气泡,或将砂滤棒浸入稀酸(如4mol/L硝酸)内迅速除去微生物,或将盐溶解,再立即清洗。二.进样器HPLC进样方式可分为:隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样。1.隔膜进样。用微量注射器将样

4、品注入专门设计的与色谱柱相连的进样头内,可把样品直接送到柱头填充床的中心,死体积几乎等于零,可以获得最佳的柱效,且价格便宜,操作方便。但不能在高压下使用(如10MPa以上);此外隔膜容易吸附样品产生记忆效应,使进样重复性只能达到1~2%。2.停流进样。可避免在高压下进样。但在HPLC中由于隔膜的污染,停泵或重新启动时往往会出现"鬼峰";另一缺点是保留时间不准。在以峰的始末信号控制馏分收集的制备色谱中,效果较好。3.阀进样。一般HPLC分析常用六通进样阀 。六通阀的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。①用部分装液法进样

5、时,进样量应不大于定量环体积的50%(最多75%),并要求每次进样体积准确、相同。②用完全装液法进样时,进样量一般定量环体积的3~5倍,这样才能完全置换定量环内的流动相,消除管壁效应,确保进样的准确度及重复性。六通阀使用和维护:①样品溶液进样前必须用0.45μm滤膜过滤,以减少微粒对进样阀的磨损。②转动阀芯时不能太慢,更不能停留在中间位置,否则流动相受阻,使泵内压力剧增,甚至超过泵的最大压力;再转到进样位时,过高的压力将使柱头损坏。③为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中,每次分析结束后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗,或先用能

6、溶解样品的溶剂冲洗,再用水冲洗。三.色谱柱柱的使用和维护:   ① 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况;柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料,因此在调节流速时应该缓慢进行。   ② 应逐渐改变溶剂的组成,特别是反相色谱中,不应直接从有机溶剂直接改变为水相。   ③ 一般说来色谱柱不能反冲,只有生产者指明该柱可以反冲时,才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。   ④ 选择使用适宜的流动相(尤其是pH),以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面

7、连接一预柱,分析柱与预柱填料相似。   ⑥ 经常用强溶剂冲洗色谱柱,清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时,对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡,每种流动相的体积至少应是柱体积的5倍以上。四.检测器UV检测器是HPLC中应用最广泛的检测器,主要性能指标:1)噪音和漂移:在仪器稳定之后,记录基线1小时,基线带宽为噪音,基线在1小时内的变化为漂移。它们反映检测器电子元件的稳定性,及其受温度和电源变化的影响,如果有流动相从色谱柱流入检测器,那么它们还反映流速(泵的脉动)和溶剂(纯度、含有气泡、固定相流失)的影响。2)

8、灵敏度(sensitivity):表示一定量的样品物质通过检测器时所给出的信号大小。3)检测限.检测器灵敏度的高低,并不等于它检测最小样品量或最低样品浓度能力的高低,因为在定义灵敏度时,没有考虑噪声的大小,而检测限与噪声的大小是直接有关的。检测限是检测器的一个主要性能指标,其数值越小,检测器性能越好。检测器的故障及排除1)流动池内

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