丙型肝炎病毒不同编码区his融合抗原的表达与纯化论文

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1、丙型肝炎病毒不同编码区His融合抗原的表达与纯化论文韩振格，乔伟振，张敏，孙艳雯，董晨，孟继鸿【摘要】目的：表达和纯化丙型肝炎病毒（HCV）Core、NS3和NS4的His融合抗原HC、HNS3和HNS4，并初步探讨其在抗体检测中的应用。方法：用重组基因工程技术，构建3种重组质粒CpET28ac(+)、NS3pET28ac(+)和NS4pET28ac(+)以及相应的工程菌；质粒经双酶切、PCR和测序鉴定正确后.freelin；然后92℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸1min30s，共35个循环；最后一个循环结束后延伸8min。PCR产物用3

2、SSpinDNAAgaroseGelPurificationKit（上海申能博彩生物科技有限公司）回收。质粒载体pET28ac(+)和PCR产物分别用BamHⅠ和XhoⅠ酶切；将酶切后的3种PCR产物分别与酶切后的质粒载体pET28ac(+)连接；取5μl连接产物转化100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞，取100μl菌液涂布于含硫酸卡那霉素（K+）的LB培养基平板，涂匀后置37℃培养过夜。挑取能在K+LB培养基上生长的菌落接种K+LB液体培养基，37℃震荡培养过夜。用PlusMiniprepsDNAPurificationSystems（Promega）抽提质粒。重组

3、质粒经PCR、双酶切、测序进行鉴定。1.2His融合抗原的诱导表达将鉴定正确的重组质粒CpET28ac(+)、NS3pET28ac(+)、NS4pET28ac(+)分别转化大肠杆菌BL21感受态细菌。取100μl菌液涂布于K+LB培养基平板，涂匀后置37℃培养过夜。挑取在K+LB培养基上生长的菌落接种K+LB液体培养基，37℃震荡培养过夜，次日转1ml过夜培养菌液至100mlK+LB液体培养基，37℃摇床继续培养至OD600nm=0.6，平均分入5支已高压灭菌的50ml大试管，再加入IPTG(Sigma)至终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8及1.0m

4、mol·L－1，37℃继续培养1h，收集细菌沉淀，SDS/PAGE确定抗原表达量较高时所需较低的IPTG浓度（即适宜诱导剂浓度）；用此浓度IPTG，分别在25、28、30、35及37℃诱导抗原表达的收集细菌沉淀，SDS/PAGE确定抗原表达量较高时的适宜诱导温度；用适宜IPTG浓度，在适宜的诱导温度下诱导抗原表达0.5、1、1.5、2及3h，收集细菌沉淀，超声裂解细菌，4℃10000r·min－1离心15min，分别收集细菌裂解上清和沉淀，SDS/PAGE确定适宜诱导表达时间，了解抗原的表达方式（可溶性/包涵体），初步制定抗原纯化方案。1.3His融合抗原纯化在优化的表达条件

5、下扩大细菌培养，诱导抗原表达，收集细菌沉淀。用50mmol·L－1TrisHCl（pH8.0）缓冲液（含有1mg·ml－1溶菌酶、0.2%脱氧胆酸钠和1mmol·L－1PMSF）重悬细菌沉淀，室温放置10min，超声裂解细菌，裂解后的菌液15000r·min－14℃离心30min，备用。可溶性抗原纯化：（1）将NTA树脂（上海申能博彩科技有限公司）装入合适的层析柱，用10倍NTA柱体积的缓冲液A（pH8.0，50mmol·L－1TrisHCl缓冲液）清洗树脂；（2）把细菌裂解上清加到NTA层析柱中，流速控制在15ml·h－1左右，收集漏过部分，用于SDS/PAGE分析蛋白

6、质的结合情况；（3）层析柱用5倍柱体积的缓冲液B（用缓冲液A配成5mmol·L－1咪唑溶液，pH8.0）冲洗树脂，流速控制在30ml·h－1左右；（4）用1.5倍柱体积的缓冲液C（用缓冲液A配成50mmol·L－1咪唑溶液，pH8.0）洗脱两次，流速控制在15ml·h－1左右，收集洗脱液；再用1.5倍柱体积缓冲液D（用缓冲液A配成80mmol·L－1咪唑溶液，pH8.0）洗脱3次，收集洗脱液；（5）用SDS/PAGE确定目的抗原在洗脱液中的分布情况。包涵体变性纯化：超声裂解后的菌液15000r·min－14℃离心15min后，弃上清，用缓冲液A配制1mol·L－1尿素溶液（p

7、H8.0），洗涤沉淀两次；再用缓冲液A配制8mol·L－1尿素溶液（pH8.0），重悬沉淀，室温作用1h，15000r·min－14℃离心30min，收集上清用于变性包涵体抗原的纯化。包涵体抗原的变性纯化步骤与可溶性抗原相同，但纯化过程中使用的缓冲液A，均换为用缓冲液A配制的8mol·L－1尿素溶液（pH8.0），其它试剂含量完全相同。纯化抗原的浓度测定：用蛋白定量试剂盒(CoomassiePlusTheBetterBradfordTMAssayKit，PIERCE)对这3种HCV重组抗原蛋白定量（严