大鼠胰腺促性腺激素释放激素受体mrna的原位杂交论文

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1、大鼠胰腺促性腺激素释放激素受体mRNA的原位杂交论文.freelRNA;原位杂交;胰脏;大鼠摘要:目的研究大鼠胰腺促性腺激素释放激素（GnRH）受体mRNA的存在及细胞定位.方法采用原位杂交组织化学法.结果胰脏的外分泌部腺上皮细胞、胰导管上皮细胞及内分泌部胰岛细胞内均可检测到较强的GnRH受体mRNA杂交信号.杂交阳性信号物质均分布在胞质内，胞核呈阴性.结论大鼠胰脏内、外分泌部均能合成GnRH受体.GnRH也是一种消化激素，它由胰脏自身合成，又作用于胰脏，可能参与胰脏内、外分泌功能的调节.Abstract:AIMTostudyonerec

2、eptor（GnRHR）mRNAexistsinratpancreasanditscellularlocalization.METHODSInsituhybridiza-tionRNAhybridizationsignals.Thesignalsdistributedincytoplasmofallpositivecellsoneproducedbypan-creaandisresponsibleformodulatingtheexocrineanden-docrinefunction.0引言许多研究已经证明促性腺激素释放激素（GnRH）

3、及其受体存在于下丘脑-垂体轴以外的器官［1］，我们先前的研究也已报道了胃肠胰系统能自身合成GnRH［2，3］.freelRNA，旨在从转录水平证明胰脏自身能合成GnRH受体，并提出GnRH也是消化激素，可能参与胰脏的内、外分泌功能的调节.1材料和方法1.1材料地高辛标记的GnRH受体cDNA寡核苷酸探针由大连宝生物生物工程有限公司合成.敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅱ（碱性磷酸酶）为武汉博士德生物工程公司产品.雄性SD大鼠3只，体质量200～250g，断颈处死打开腹腔，取出胰脏置Bouin液中室温固定过夜，按石蜡包埋程序将胰脏组织包埋于蜡

4、块内，在严格限制RNA酶污染的条件下切成6μm厚的切片，贴于预先涂有APES的载玻片上.1.2方法探针的制备参照大鼠脑垂体GnRH受体cDNA序列设计而成［6］，序列如下:5’-ATGTAT-GCCCCAGCCTTCATGATGGTGGTGATTAGCC-TGGATC-3’，经大连宝生物公司合成并在5’端作地高辛标记.切片经脱蜡水化后，经3gL-1H2O2-甲醇室温处理30min，蒸馏水洗涤3次，0.5molL-1TBS（pH7.3）1∶200稀释的proteinaseK于37℃消化20min，40gL-1多聚甲醛5min，蒸馏水洗5mi

5、n，3次，切片空气干燥后，每张切片滴加含2.0mgL-1标记探针的原位杂交液20μL，置湿盒中于42℃杂交18h，2×SSC室温洗涤5min，3次，0.1×SSC洗涤10min，2次，滴加封闭液置室温20min，不洗，滴加小鼠抗地高辛抗体置室温孵育2h，0.5molL-1TBS洗5min×3次，滴加生物素化羊抗小鼠IgG于37℃孵育1h，0.5molL-1TBS洗5min，3次，滴加SABC-AP于37℃孵育30min，0.5molL-1TBS洗5min，3次，最后用BCIP/NBT显色液于室温显色20～30min，水洗中止反应，梯度乙醇

6、脱水，二甲苯透明，中性树胶封片.阴性对照作如下设置:将切片用RNA酶进行预处理后杂交;用不含探针的杂交液进行杂交;用正常小鼠血清取代小鼠抗地高辛抗体进行孵育.图1－图5略2结果GnRH受体mRNA杂交信号呈蓝色，背底不着色，反差明显，阳性细胞易于识别.3种阴性对照试验均呈阴性反应.胰脏的周边部分GnRH受体mRNA杂交反应信号较强，中央部分杂交信号较弱（Fig1），周边部分外分泌部的全部腺上皮细胞均可检到很强的GnRH受体mRNA杂交反应信号，信号物质分布于胞质，核呈阴性（Fig2）.胰脏的中央部分外分泌部只有部分腺上皮细胞可检到GnRH

7、受体mRNA杂交信号，这些细胞散在分布，杂交信号物质分布于胞质，核呈阴性（Fig3）.胰脏外分泌部的导管上皮细胞也可检测到GnRH受体mRNA杂交反应信号，信号物质也分布于胞质内，核呈阴性（Fig4）.胰岛细胞中也可检到GnRH受体mRNA杂交信号，这些细胞呈团、呈索散在分布于胰岛内，信号物质也分布在胞质内，胞核为阴性反应（Fig5）.3讨论GnRH受体由327个氨基酸构成，有7个跨膜结构域，属G蛋白偶联受体，哺乳类脑垂体性腺细胞上的GnRH受体和GnRH的结合有高度特异性，光亲和标记、层析电泳证明GnRH受体为Mr60000的糖蛋白，有

8、3个N-糖基化位点，在90，98和291位的酸性氨基酸残基可能和GnRH的精氨酸相互作用，而发挥GnRH的生理调节功能［7，8］.GnRH在下丘脑-脑垂体轴外产生并在下丘脑-脑垂体轴外发挥生物