生物被膜大肠埃希菌ampc酶、超广谱β

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1、生物被膜大肠埃希菌AmpC酶、超广谱β【摘要】目的探讨大肠埃希菌生物被膜(biofilm，BF)的耐药情况，为临床合理应用抗生素提供理论依据。方法应用改进的平板培养法建立大肠埃希菌BF模型，用银染法和扫描电镜观察鉴定。采用改良三维试验法检测超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)及AmpC酶。结果浮游大肠埃希菌(A组)单产AmpC，单产ESBLs酶及同时产ESBLs和AmpC酶的菌株分别为5.0%(2/40)、30.0%(12/40)和12.5%(5/40)；BF大肠埃希菌(B组)单产AmpC酶，单产ESBLs及同时产ESBLs

2、和AmpC酶的菌株分别为10.0%(4/40)、45.0%(18/40)和22.5%(9/40)。对A组和B组的检出率两两分别进行χ2检验，结果均为P<0.05。产酶有BF大肠埃希菌对10种抗生素(除亚胺培南全部敏感外)的耐药率均较高。结论BF的形成和产生ESBLs及AmpC酶的协同作用是大肠埃希菌耐药的主要原因之一。【关键词】大肠埃希菌；生物被膜；超广谱β-内酰胺酶；AmpC酶ABSTRACTObjectiveToevaluatetheresistancemechanismofEscherichiacoligro

3、,andtoprovidethetheoreticalguidetoselectantimicrobialagentsinclinic.MethodsModelofEscherichiacolibacterialbiofilmodifiedflat-boardmethodandidentifiedbythemethodstainingicroscopy.ESBLsandAmpCβ-lactamaseprovedthree-dimensiontest.ResultsThedetectionratesofAmpC,ESBLs

4、andESBLsplusAmpCβ-lactamaseEscherichiacoliEscherichiacoliEscherichiacoliproducingAmpCandESBLsto10kindsofantibioticsipenem).ConclusionOneofthemainreasonsthatEscherichiacolipCandbiofilm.KEY。所有菌株均经VITEX自动化微生物分析仪鉴定。培养基胰酶大豆肉汤(TSB)为法国BioMerieux公司产品。主要仪器与药品有医用硅胶膜(1.5mm，

5、北京医用硅胶膜研究所)、24孔板(天津有机玻璃制品厂)、扫描电镜(S-800日本HITACHI公司)、超声清洗器(GX-250，北京医疗设备二厂)、低温超速离心机(上海安亭公司)和LKB2117等电聚焦系统(LKB公司)。1.2方法(1)BF模型的建立采用改进的平板培养法，在硅胶膜上建立大肠埃希菌的BF模型，并用银染法和扫描电镜观察鉴定［2］。(2)分组大肠埃希菌40株，经37℃24h孵育，比浊法配制1.5×108CFU/ml菌悬液，等分为A组(浮游细菌组)和B组(BF组)。(3)粗酶提取物的制备［1］将A组及B组大肠埃

6、希菌在37℃下孵育16h。B组细菌经孵育后将硅胶膜从培养基中移除，用生理盐水清洗2次，每次15min，除去浮游菌，用150H琼脂平皿，置入抗生素纸片。用无菌刀片在离纸片边缘5mm处由内向外切一条细沟长约15mm、宽约1mm，将30μl粗酶提取物由里向外加入沟槽内，避免粗酶提取物溢出沟槽，置MH琼脂平皿36℃过夜，若观察到狭缝与抑菌圈交接处出现扩大的长菌区域，视为三维试验阳性。氯唑西林单独加入抑酶试验阳性即AmpC酶阳性，克拉维酸单独加入抑酶试验阳性即ESBLs阳性，同时加入氯唑西林和克拉维酸抑酶试验阳性即AmpC酶和ES

7、BLs阳性。用阴沟肠杆菌029M作为持续高产AmpC酶阳性对照，阴沟肠杆菌029和肺炎克雷伯菌ATCC700603作为阴性对照。肺炎克雷伯菌ATCC700603作为ESBLs阳性对照，阴沟肠杆菌029M作为阴性对照。(5)药敏试验采用KB法对B组(BF组)细菌进行药敏试验，操作及判断标准采用美国国家临床实验室标准化研究所(CLSI/NCCLS)2001。(6)统计方法采用χ2检验，以P<0.05作为有显著性差异的判定标准。2结果2.1BF模型的建立大肠埃希菌在硅胶膜培养至72h的扫描电镜照片，可见细菌被浓密的纤维样

8、的粘液物质包绕，菌体之间借纤维粘液丝相连。经银染法和扫描电镜观察证明其为BF(照片略)。2.2AmpC酶和ESBLs的检出率BF大肠埃希菌单产AmpC酶、单产ESBLs及同时产AmpC酶和ESBLs菌株的检出率明显高于其相应的普通浮游细菌产酶菌株(P<0.05，表1)。2.3B组(BF组)的药敏实验非产酶BF大