幽门螺杆菌粘附素基因alpa的克隆与高效表达论文

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1、幽门螺杆菌粘附素基因alpA的克隆与高效表达论文白杨张亚历王继德杨云生张兆山周殿元【关键词】,.freelole-cular;geneexpressionAbstract:AIMToisolateandexpressealpAgenefromHe-licobacterpylori.METHODSThealpAgeneplifiedfromH.pylorichromosomalbyPCRandinsertedintotheprokaryotieexpressionvectorpET-22b（+）.TherebinantplasmidedintotheBL21（DE3）E.c

2、olistrain.RESULTS1.5kbalpAgeneountedto31.9%ofthetotalbacterialproteinafterinducedentoftheH.pylorivaccine.0引言幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，Hp）已被确认是慢性胃病（包括胃炎和消化性溃疡）的主要病原因子，同时与胃腺癌、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤的发生亦密切相关［1-6］.目前根除Hp的主要手段是抗菌疗法，但有相当的局限性.疫苗接种最有效，在Hp疫苗的研制中，获得了不同程度的保护作用，但仍不理想.如从粘附素出发寻找保护性抗原从而阻断Hp对于胃粘膜的粘附

3、，使之在胃蠕动时随食物一起被排空，也许是一种有益的尝试.AlpA是已被证实的Hp粘附素中的一种［7］，目前国内尚未见有关的研究报道.我们对粘附素AlpA的基因进行了克隆和表达，为构建Hp基因工程疫苗打下了基础.1材料和方法1.1材料菌株BL21（DE3）、质粒pET-22b（+）和幽门螺杆菌SS1为本所保存.限制性内切酶NotⅠ，NocⅠ及T4DNA聚合酶、VentDNA聚合酶购自Neega公司，测序质粒纯化试剂盒购自德国Qiagen公司，其他试剂为国产分析纯.1.2方法从固体培养基上刮取生长良好的Hp菌落，按基因组DNA小量制备法提取Hp染色体DNA.质粒的快速抽提及大

4、量制备均采用碱变性法.根据文献［8］设计引物，在其5’端加上合适的限制性酶切位点，由博亚公司合成.序列如下:AlpA1:5’-TGGCCATGGATTGCGCTAGCATAAGTTA-3’NocⅠAlpA2:5’-AGTGCGGCCGCGAATGAATACCCATAAGA-3’NotⅠ热启动法进行PCR，95℃变性30s，55℃退火50s，72℃延伸90s，35个循环后再延伸10min.8gL-1琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果.质粒和目的基因DNA经NotⅠ和NocⅠ双酶切，玻璃奶回收酶切片段，T4连接酶作用下16℃连接12h，转化宿主菌BL21（DE3）.重组转化子经筛选和

5、鉴定后，采用373ADNA自动分析仪进行全自动测序.AlpA阳性克隆经IPTG诱导表达后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析.外周质部分表达产物:4℃，12000g离心1min，收集IPTG诱导培养物.将细菌沉淀重悬于30mmolL-1Tris-CL（pH8.0）～1mmolL-1～ED-TA-200gL-1蔗糖中，冰浴10min，以12000g离心10min，上清即为外周质部分.胞内可溶性和包涵体部分:同上法收集IPTG诱导培养物菌体.弃上清，菌体沉淀重悬于1/10体积的PBS中，在冰浴条件下超声破碎至溶液较清亮，以12000g于4℃离心15min，上清即为胞内可溶性部分，沉淀

6、为包涵体部分.2结果2.1粘附素AlpA基因片段的序列粘附素AlpA基因PCR扩增结果电泳分析发现在1500bp左右有一条带，大小与预计相符（Fig1）.将PCR产物经NotⅠ和NocⅠ双酶切后，定向插入经同样双酶切的pET-22b（+）载体中，获得重组质粒命名为pET-22b（+）/AlpA（Fig1）.重组质粒经NotⅠ和NocⅠ双酶切后电泳初步鉴定结果与预期相符.直接以重组质粒pET-22b（+）/AlpA为模板进行测序，得到了克隆片段的DNA序列，与Odenbreit等［6］报道的几乎一致，同源性高达97.3%.2.2粘附素AlpA基因在大肠杆菌中的表达将粘附素A

7、lpA阳性克隆株在LB培养液（含100mgL-1氨苄青霉素）中37℃过夜培养，然后按1%转接至含氨苄青霉素的LB培养液中，继续培养至A值为0.6～0.8，加IPTG至终浓度为0.1mmolL-1，诱导表达3h，离心收集菌体，取其周质的渗透休克液、菌体超声后的上清以及沉淀进行100gL-1SDS-PAGE电泳分析（Fig2）.结果发现，经诱导后表达Mr为56500的蛋白，与预期一致，凝胶自动扫描分析，其粘附素AlpA重组蛋白占菌体总蛋白的31.9%，其中可溶性表达占上清的23.7%，包涵体占沉淀的64.8%.图1－图2略3讨论在