toll样受体4在肾间质纤维化中的表达及意义

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1、·2011届硕士研究生毕业论文Toll样受体4在肾间质纤维化中的表达及意义75%酒精495ml浓盐酸5ml(3)10%碳酸锂：饱和碳酸锂40ml蒸馏水360ml(4)0.01mol/LPBS(Ph=7.4)(5)0.011mol/L柠檬酸缓冲液(pH=7.6)(6)DAB显色液(现用现配)(7)3%过氧化氢溶液(8)10%中性福尔马林溶液：甲醛100mlNa2HPO44gNaH2PO46.5g蒸馏水~1000ml（9）0.01M/L的PBS(PH7.2)NaCl8gNa2HPO41.15gKH2PO

2、40.2g（NaH2PO4）加双蒸水~1000ml（10）pH6.0枸橼酸盐缓冲液0.1M枸橼酸枸橼酸21.01g双蒸水~1000ml0.1M枸橼酸钠枸橼酸钠29.41g双蒸水~1000ml取0.1M枸橼酸9ml和0.1M枸橼酸钠41ml，再加入双蒸水450ml，即配成0.1M的枸橼酸缓冲液（pH6.0±0.1）。4.2.2免疫组化具体步骤如下（Envision两步法）：取肾脏组织↓10%中性甲醛固定···6···2011届硕士研究生毕业论文Toll样受体4在肾间质纤维化中的表达及意义↓脱水、透明和

3、石蜡包埋↓石蜡切片3um厚，72℃烘烤1h↓石蜡切片常规脱蜡、酒精梯度水化至水↓PBS洗3×5min↓3%双氧水封闭内源性过氧化物酶，室温下孵育15min↓PBS洗3×5min↓高压锅进行高压热修复，煮沸喷气后计时3min(0.01M柠檬酸钠盐pH6.0，2000ml，将切片浸入，自然冷却)↓PBS洗3×5min↓滴加一抗抗体作用，4℃孵育过夜↓PBS洗3×5min↓滴加二抗免疫组化试剂，370C，20min↓PBS洗3×5min↓滴加DAB显色(新鲜配制)，光镜下控制显色，自来水冲洗终止反应↓苏木

4、素衬染5min，水洗↓盐酸酒精分化3sec，水洗。碳酸锂蓝化↓酒精脱水，二甲苯透明，常规树脂封片↓结果：阳性呈棕黄色或黄褐色每批染色均用PBS代替一抗作阴性对照，对应阳性切片作阳性对照0.1结果评价0.1肾小管间质的病理改变切片经HE染色后，在显微镜200倍下依序分别在左上、左下、右上、右下、中间各取2个视野，每张切片共10个视野，依据肾间质纤维化、肾间质炎性细胞···7···2011届硕士研究生毕业论文Toll样受体4在肾间质纤维化中的表达及意义浸润、肾间质水肿、红细胞管型、蛋白质管型、肾小管扩张

5、、肾小管萎缩、肾小管细胞空泡变性等8项指标来观察肾间质病理改变，并作肾小管间质损伤指数（tubulointerstitialdamageindex，TDI）评分。具体评分标准：①肾间质纤维化：无0分；轻度（累及范围<25%）1分；多灶状（累及范围25%—50%）2分；弥漫性（累及范围>50%）3分；②肾间质炎性细胞浸润：无0分；轻度（累及范围<25%）1分；多灶状（累及范围25%—50%）2分；弥漫性（累及范围>50%）3分；③肾间质水肿：小管互相紧靠0分；小管间有轻度节段分离1分；小管间有弥漫轻度

6、或中度节段分离2分；小管上皮细胞变薄与小管基底膜弥漫性分离3分；④红细胞管型：无0分；偶见1分；<10%2分；>10%3分；⑤蛋白管型：无0分；偶见1分；<10%2分；>10%3分；⑥肾小管扩张：···8···2011届硕士研究生毕业论文Toll样受体4在肾间质纤维化中的表达及意义无0分；轻度扩张1分；伴随有小管上皮扁平的中度扩张2分；小管直径超过小球直径的中度扩张3分；⑦肾小管萎缩：无0分；轻度（累及范围<25%）1分；多灶状（累及范围25%—50%）2分；弥漫性（累及范围>50%）3分；⑧上皮细

7、胞空泡变性：无0分；轻度或节段1分；弥漫轻度或节段中性2分；严重并弥漫3分；0.1免疫组化检测检测指标为：TGF-β1、TLR4。组织染上棕黄色或黄褐色为阳性表达，主要累及肾小管上皮细胞及肾间质。采用Biomias2001图象分析系统(四川大学图象图形研究所制)对上述指标进行免疫组化半定量分析。方法如下：1、在X400倍OLYMPUS(BX50)光学显微镜下，通过SONY摄像头将肾组织免疫组化染色切片图象采集并输入本图象分析系统进行灰度值测量。2、每例标本分别随机选取5个视野，每个视野选取5个阳性区

8、域用目标测量法测量透光度，计算其平均灰度值，表达信号越强，其灰度值越低。0.2统计学分析应用SPSS17.0统计软件对数据进行统计学分析处理，计量资料用均数±标准差表示。方差齐者，多组间采用单因素方差分析（OneWayANOVA），组间两两比较用LSD法；如方差不齐，采用Tamhane’sT2法；各项指标之间做Pearson相关分析。以上均以P<0.05有统计学意义。···9···2011届硕士研究生毕业论文Toll样受体4在肾间质纤维化中的表达及意义结果0.1肾脏的