缺氧调控报告载体的构建与鉴定

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1、缺氧调控报告载体的构建与鉴定杨洁，李占亭，杜德伟，柴青焕，王丽，张惠中，孙脊峰【关键词】荧光素酶Constructionandidentificationofhypoxiaregulatoryreportervectors　　【Abstract】AIM:Toconstructthefireflyluciferasereportergenevectorsregulatedbyhypoxiaresponsepromoters.METHODS:Theoligonucleotidesofhypoxiaresponseelem

2、ent(HRE)andamutationcontrolotersamplifiedbyPCRedigestion.Also,thesequencesofthevectorsotersakesitpossibletofurtherinvestigatetheirpotencyofhypoxiaregulation.　　【Keyents；luciferase；reportergene　　【摘要】目的：构建能用来检测缺氧应答启动子转录调控作用的萤火虫荧光素酶报告载体.方法：合成缺氧应答元件(HRE)的寡核苷酸序列及其突变对

3、照，克隆入pCIneo，构建HRE/CMV重组载体.然后采用PCR方法将HRE/CMV启动子定向亚克隆入pGL3Basic.结果：酶切和测序鉴定分析，所克隆的基因产物酶切结果与预期值一致，序列无碱基的突变.结论：成功构建了缺氧应答启动子的荧光素酶报告载体，为进一步研究其缺氧调控作用提供了条件.　　【关键词】转录；调控；缺氧;反应元件；荧光素酶；报告基因　　0引言　　目前已开发出多种报告载体用于研究启动子和/或增强子的调控活性〔1-3〕，如氯霉素乙酰转移酶报告载体，β半乳糖苷酶报告载体，β葡萄糖醛酸酶报告载体，碱性磷酸

4、酶报告载体，绿色荧光蛋白报告载体以及荧光素酶报告载体.其中荧光素酶报告载体以其检测迅速、敏感和重现性好，被广泛应用于启动子和增强子转录调控的研究〔4〕.在基因调控机制研究中，应用报告载体对可能调控哺乳动物基因表达的基因元件进行定量分析是极为重要和必要的.缺氧应答元件(hypoxiaresponseelement,HRE)是对缺氧可做出应激反应的缺氧反应基因内一段小于100bp的单拷贝或多拷贝的顺式作用元件，能够与转录因子缺氧诱导因子1(hypoxiainduciblefactor1,HIF1)结合，启动缺氧反应基因的

5、转录，介导细胞对缺氧的反应〔5-6〕.本文将各种不同缺氧应答基因的HRE与CMV启动子组合成缺氧应答启动子，构建其荧光素酶报告载体，快速对该遗传调控元件进行功能性分析.　　1材料和方法　　1.1材料TaqDNA聚合酶及KpnⅠ，HindⅢ限制性内切酶购自TaKaRa公司.质粒小量制备与纯化试剂盒、PCR试剂购自天为时代公司.BglⅡ，SgfⅠ，IPpoⅠ限制性内切酶和pCIneo真核表达载体、pGL3Basic报告基因载体、JM109菌种由Promega公司提供.HREs的正向和反向单链由博雅公司合成（两端带有限制性

6、内切酶的粘端切口）.引物由奥科公司合成.测序由基康公司完成.其他试剂为进口或国产分析纯.　　1.2方法　　1.2.1HRE退火合成的HRE单链用去离子灭菌水稀释成3g/L，退火反应体系：正向单链2μL，反向单链2μL，1×退火液将总体积补至50μL（退火液的配方：醋酸钾0.98g，HEPES0.72g，KOH0.18g，醋酸镁0.043g，去离子水100mL，溶解后高压蒸气消毒，备用）.退火反应条件：95℃5min变性后，70℃10min，关掉水浴锅，缓慢降至4℃，过夜.　　1.2.2HRE/CMV重组载体构建带有B

7、glⅡ和SgfⅠ切口的HRE正向和反向单链退火成双链后定向克隆入经相应酶切去除CMV增强子的pCIneo载体，构建HRE/CMV重组载体，转化至JM109大肠杆菌，挑选单克隆，提取重组质粒后对其行酶切鉴定，对符合预期值的克隆进行测序.　　1.2.3HRE/CMV报告载体的构建以测序正确的HRE/CMV重组载体为模板，设计并合成含KpnⅠ，HindⅢ限制性内切酶位点的引物，采用PCR方法克隆HRE/CMV调控序列.PCR反应体系：2×TaqPCRMasterMix，12.5μL；Primer1，1μL；Primer2，

8、1μL；质粒模板，1μL；总体积，25μL.PCR反应条件：95℃5min变性后，95℃，30s，68℃，45s，72℃，45s，30个循环.PCR产物经电泳凝胶回收后，进行KpnⅠ和HindⅢ双酶切，定向克隆入经相应酶切的萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL3Basic，转化至JM109大肠杆菌，挑选单克隆，提取重组质粒后对其行酶切鉴定，对符合预