细菌内毒素检查方法综述

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1、细菌内毒素检查方法综述【关键词】细菌内毒素检查法；,,,机理；,,,预实验；,,,特殊值　　细菌内毒素检查是静脉、鞘内给药药物以及放射性药物等质量检查的一个重要方面。以前，细菌内毒素检查用家兔热原法进行，自从1980年《美国药典》第20版收载了细菌内毒素实验以来，《英国药典》《欧洲药典》《日本药局方》《中国药典》等相继收载了该方法。1995年《美国药典》第23版已收载了471种药品进行细菌内毒素检查，而《中国药典》1995年版也收载了12种药品进行细菌内毒素检查〔1〕，2000版更收载有47种药品利用此

2、方法进行热原检查。细菌内毒素检查法已逐渐代替家兔热原检查法，显示出其在检查热原方面的重要性。本文对细菌内毒素检查法作一综述。　　1方法、机理及影响因素　　1.1应用的方法目前，美国药品食品管理局（FDA）承认3种鲎试剂检测细菌内毒素含量的方法，即凝胶（gelclot）法、生色（chromogenic）法和动态浊度（keniticturbidimetry）法〔2〕。近年来较新的方法有水箭电泳免疫法（测残余蛋白）、酶联免疫吸附法（测残余酶）。后者所需鲎试剂仅相当于凝胶法的1/100，且灵敏度更高，抗干扰能力

3、更好。《中国药典》1995年版只采用凝胶法。凝胶法是将等体积的供试品溶液和新配制的鲎试剂（TAL）溶液在试管中混匀，一般各0.1ml，（37±1）℃反应（60±2）min。如果被检测的溶液不含干扰凝集反应的因素，且其含有内素素浓度等于或大于所用鲎试剂的灵敏度（λ）时，就会在试管中显示阳性反应，即形成凝胶；否则呈阴性反应，即呈澄明溶液或轻度混浊，视内毒素的浓度而定〔1〕。该反应极其灵敏，凝胶形成速率与内毒素浓度成正比，并受温度、反应物中Ca2+/Mg2+离子浓度和pH等因素的影响〔3〕。同样，《中国药典》

4、2000年版也只采用凝胶法。　　1.2凝胶法鲎试剂与内毒素反应的机理见图1。　　图1凝胶法鲎试剂与内毒素反应的机理（略）　　2影响细菌内毒素检查的因素　　2.1检品的干扰pH值、离子浓度以及某些干扰成分，都会影响到检查结果的准确性，得到所谓“假阳性”或“假阴性”结果。只有证实检品对凝集反应无干扰之后，检查的结果才是可信的。判断检品是否有干扰要做检品的干扰实验。　　2.2鲎试剂的非特异性内毒素不是唯一能激活鲎试剂凝集系统的物质，还有其他物质可以通过G因子这个“旁路”激活鲎试剂的凝集系统。因此鲎试剂并不是专

5、一对内毒素反应的试剂。由旁路反应产生的阳性结果称细菌内毒素检查的“假阳性”。　　2.3影响鲎实验的因素〔4〕　　2.3.1混合液的pH6.0~8.0才能形成最佳凝集。　　2.3.2保温温度：温度应为（37±1）℃〔5〕。　　2.3.3保温时间：（60±2）min〔5〕。　　2.3.4在鲎试验过程中应防止使试管受到振动。　　2.3.5所用器皿均应彻底洗涤和冲洗干净。　　2.3.6阳性对照存在。　　3特殊值的确定　　3.1药品的内毒素限值（L）药品细菌内毒素检查是一种限度实验，首先必须确定供试品的细菌内毒素

6、限值。当供试品含内毒素低于这个限值时，按规定给药途径用药，就不会引起致热原反应；相反就有可能引起热原反应〔1〕。药品细菌内毒素限值确定的方法有3种。　　3.1.1药典给出药典规定细菌内毒素检查的品种，在药典正文可以查到相应的L值。《中国药典》1995年版规定了12种注射剂的L值，2000年版规定了47种注射剂的L值，USPXXⅢ规定了471种注射剂的L值。　　3.1.2根据热原检查的兔剂量计算L=K/M，M规定的给药途径，药品的家兔注射剂量，以ml/kg，mg/kg，μ/kg等表示；K为规定的给药途径；

7、临床无任何不良反应的内毒素阈值，以Eu/kg表示。静脉（包括im，ip，sc，ia）：5.0Eu/kg；放射性药品：2.5Eu/kg；鞘内：0.2Eu/kg。　　3.1.3根据人的最大注射剂量计算L=K・，M为规定的给药途径，人的最大注射剂量同样以ml/kg，mg/kg，μ/kg等表示；VD）做药品的细菌内毒素检查时，当品种的L值与所选用的鲎试剂灵敏度（λ）相等时，若经干扰实验证实无干扰，可以直接检查。但许多药品的L值往往大于鲎试剂的灵敏度（L＞λ），在这种情况下，若直接检查，得到阳性结果并不能说明该药

8、品的内毒素含量超过限值。因此，当L＞λ，需要对检品作适当的稀释，但稀释的倍数不能超过一个有效的限度，这就是“最大有效稀释”，用MVD表示。其计算公式如下：MVD=L/λ。　　4重要的实验──预实验　　4.1鲎试剂标示灵敏度的复核实验鲎试剂是一种有生物活性的试剂，其稳定性受多种因素的影响，药品的细菌内毒素检查又是关系到药品安全性的重要检查项。因此各国的细菌内毒素检查法都规定：每批鲎试剂在用于细菌内毒素检查前都必须对该批试剂标示的灵敏度进行复核