何首乌提取物聚酰胺柱层析流分促血管内皮细胞生长活性研究

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1、何首乌提取物聚酰胺柱层析流分促血管内皮细胞生长活性研究【摘要】　　目的初步探讨何首乌提取物聚酰胺柱层析流分对人脐静脉血管内皮细胞增殖的影响。方法MTT比色法检测何首乌提取物聚酰胺柱层析流分对人脐静脉血管内皮细胞生长的促进作用；HE染色法观察其流分对人脐静脉血管内皮细胞形态学的影响。结果经聚酰胺柱层析洗脱的何首乌流分对人脐静脉血管内皮细胞增殖具有不同的作用，其中D流分随着浓度的增加，对人脐静脉血管内皮细胞增殖具有促进作用，显微镜下观察到细胞的数量及分裂相增多，B和C流分对细胞的增殖影响不大，而A流分对

2、血管内皮细胞具有抑制生长作用，细胞的数量减少，核固缩。结论何首乌提取物聚酰胺柱层析流分中含有促人脐静脉血管内皮细胞生长的活性物质。【关键词】何首乌聚酰胺柱色谱人脐静脉血管内皮细胞MTT比色法HE染色法　　Abstract:ObjectiveToinvestigatetheproliferationeffectsonhumanumbilicalveinvascularendothelialcells(HUVECs)ofthefractionsisolatedfromPolygonummultiflor

3、mThunbextractedidecolumnchromatography.MethodsTheactivityofpromotingHUVECsgroetricassay.ThechangesofHUVECsmorphologypolyamidecolumnchromatographyhaddifferentproliferationactivitiesonHUVECs.TTcolorimetricassay；HEstain　　何首乌PolygonummultiflormThunb.系蓼科植物何

4、首乌的干燥块根，具有乌须发、悦颜色、补肝肾、抗衰老之良效〔1〕。现代药理学研究表明其醇提或水提液具有提高免疫力、抑制血小板聚集、舒张血管、抗氧化等作用，且这些作用与其中的活性成分二苯乙烯苷（2,3,5,4’-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glucoside）有关〔1，2〕。二苯乙烯苷又称芪多酚，属多羟基芪类化合物，现代药理学研究表明，其具有清除自由基〔2〕、降低胆固醇〔3〕、保护肝脏等〔4〕作用。本实验采用MTT法和HE染色法观察何首乌提取物聚酰胺柱层析流分对人脐静脉血

5、管内皮细胞增殖的影响，为何首乌的进一步开发和利用提供依据。　　1材料与仪器　　1.1材料　　聚酰胺（60～80目）和聚酰胺薄膜（10cm×10cm）购于浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂；何首乌饮片购自广西医药公司；人脐静脉血管内皮细胞购自武汉大学保藏中心。　　1.2仪器　　RE-52型旋转蒸发仪(上海博通)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；紫外线检出器(日本)；二氧化碳培养箱(ThermoFormaMODEL3111)；∑960酶标仪；倒置相差荧光显微镜（OlympusCXZI

6、FSZ）；生物显微镜（日本Olympus）。　　1.3试剂乙醇；丙酮；甲醇(成都市科龙化工)；冰乙酸(上海实意化学试剂有限公司)；无水乙醇(重庆川江化工)；氯仿(广东省化学试剂工程技术研究开发中心),以上试剂级别均为分析纯。RPMI1640培养基（GIBCOInvitrogencooperation）；新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)。　　自配试剂：2%三氯化铁-2%铁氰化钾显色剂；0.5%胰蛋白酶溶液；PBS；苏木精染液；伊红染液及1%稀盐酸乙醇溶液。　　2方法　　2.1何首乌流分提取

7、分离取2kg何首乌粉用4倍量70%乙醇回流提取，浓缩后的总浸膏依次采用环己烷、醋酸乙酯、正丁醇分别进行萃取。采用聚酰胺柱层析法，以蒸馏水-乙醇为洗脱剂对正丁醇层浸膏进行分离，收集各流分；点样，在365nm处用紫外灯观察，并以2%三氯化铁-2%铁氰化钾显色跟踪检测，合并相同流分，减压浓缩。按洗脱顺序分别得到A，B，C，D流分组。　　2.2活性研究　　2.2.1细胞的培养人脐静脉血管内皮细胞培养于含体积分数为10%热灭活新生牛血清的培养液中，置二氧化碳培养箱，在37℃，5％CO2条件下培养。　　2.2.

8、2MTT法测定细胞生长增殖实验取指数生长期细胞用0.5%胰蛋白酶消化,加入含小牛血清的培养液计数并稀释至1×104个/ml。将稀释的细胞悬液按100μl/孔接种至96孔板,置37℃,5%CO2培养箱中孵育24h至细胞贴壁后,选择A，B，C，D4种流分，每组设5个浓度梯度加入至96孔板中,每个浓度设3个平行孔。同时设PBS空白对照组6孔，继续培养72h,取出孔板，每孔加入20μl5mg/ml的MTT,37℃、5%CO2条件下孵育4h,弃尽孔内液,每孔中加入200μl的D