离体培养条件下伊犁贝母四倍体诱导及筛选

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1、离体培养条件下伊犁贝母四倍体诱导及筛选作者：刘传军王晓军郝秀英李晓瑾赵民安张蜀敏曹玉锦阳立恒【摘要】目的选育四倍体伊犁贝母FritillariapallidifloraSchrenk新种质，为高产、高生物碱含量的伊犁贝母育种打下基础。方法以鳞茎诱导出的不定芽为材料，将其接入含有2％二甲基亚砜、不同浓度秋水仙素的液体MS培养基诱导四倍体，利用处理后不定芽表型变化及染色体计数筛选鉴定四倍体伊犁贝母。结果成功获得了染色体加倍的伊犁贝母新材料，其中以含秋水仙素400mg/L浸泡24h效果最佳，四倍体诱导率达到33.3％，四倍体植株与二倍体对照相比，二者在表型性状

2、、显微结构上有明显区别。结论四倍体植株体型大、生长优势明显，离体条件下利用不定芽诱导多倍体是伊犁贝母倍性育种的一条有效途径。【关键词】伊犁贝母；四倍体；秋水仙素　　Abstract：ObjectiveTocreatenebulbpiecesmergingincolchicinesolutionofdifferentconcentrations．ResultsTetraploidsostefficienttreatmentforinducingtetraploidg/Lcolchicinesolutionfor24h,theinducingratecoul

3、dbeupto33.3%．Theinducedtetraploidsexhibitednotabledifferenceorphology，physiology，andmicroscopicstructure．ConclusionThetetraploidfritillariashotoinducetetraploidfrommultipleshootsedicinalplantsofFritillariapallidifloraSchrenk．　　Keyperialine)和西贝素苷(imperialine-3β-D-glucoside)为主要药效成分

4、［1］。由于人工栽培繁殖系数低、品系退化［2］，野生伊犁贝母长期以来被大量采挖，分布面积日益缩减，资源破坏严重，已成为国家三级濒危保护植物，因此探求伊犁贝母新种质是科研工作的当务之急。　　多倍体植物由于染色体加倍，往往具有根茎叶的巨大性，能较好地满足药材生产的要求。同时植物染色体倍性的改变，导致部分基因表达活性的变化从而引起代谢产物含量的变化［3，4］。孙静贤等［5］综述了多种多倍体植物次生代谢产物较二倍体增加，L.DeJesus-Gonzalez等［6］报道四倍体黄花蒿ArtemisiaannuaL.产生青蒿素（artemisinin）的量为二倍体的6

5、倍。伊犁贝母是二倍体（2n=2x=24），多倍体诱变育种方面未见报道，本研究通过秋水仙素处理鳞茎切块诱导产生的不定芽，进行多倍体育种研究，以提高伊犁贝母鳞茎产量及药用成分的含量，克服栽培种品系退化问题。　　1材料　　伊犁贝母鳞茎由新疆中药民族药研究所提供、鉴定。　　2方法　　2.1不定芽诱导与增殖将伊犁贝母新鲜鳞茎用水洗净表面，大鳞茎于太阳下晾晒12～24h，小鳞茎晾晒8～12h，然后将鳞茎在超净工作台上进行消毒处理，75％酒精30s，0.1％升汞6～10min，15％双氧水30～60min，无菌水冲洗2～3次。处理后的鳞茎切成0.5cm×0.5cm大小

6、，接入不定芽诱导培养基：MS＋KT0.5～1.0mg/L+NAA0.1～0.4mg/L，（20±1）℃，2000lx，18h/d培养。　　2.2四倍体的诱导将伊犁贝母不定芽切成单芽浸泡在2％二甲基亚砜、100～800mg/L秋水仙素的液体MS培养基中，同时以单芽接入不加二甲基亚砜和秋水仙素的液体MS培养基作对照，均置于转速为100r/min的摇床上处理12～36h，随后转入不含秋水仙素的液体MS培养基中100r/min摇床培养4h，再用无菌水冲洗2～3次后，接入MS固体空白培养基，每隔10d重复上述处理1次，共处理3次，最后于无菌滤纸上约20min晾干后

7、转入：MS＋KT0.5～1.0mg/L+NAA0.1～0.4mg/L固体培养基中培养。　　2.3四倍体筛选与染色体鉴定四倍体伊犁贝母的筛选与鉴定根据四倍体与二倍体在形态学上差异，不定芽生长势、叶宽、叶色、叶厚，解剖学上上表皮气孔大小及密度、保卫细胞叶绿体含量的差异筛选出疑似株。将疑似株转入生根培养基生根，待根尖长至0.2～0.5cm时取疑似株幼嫩根尖和茎尖，采用薛恒钢等［7］常规压片法统计染色体条数：4℃下0.002mol/L8-羟基喹啉预处理4h、卡诺固定液固定12～18h，1mol/L盐酸60℃解离8～10min，改良苯酚品红染色液染色5～10min

8、，压片统计染色体数目。每个生根的不定芽取4个根尖，每个根尖统计20个分裂相细胞，