中期因子在急性髓系白血病患者的表达及临床意义

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1、中期因子在急性髓系白血病患者的表达及临床意义作者：杨琳，董作仁，潘崚，罗建民，徐世荣【摘要】为了探讨中期因子(midkine，MK)与急性髓系白血病(AML)患者预后的关系，本研究采用半定量RT-PCR方法检测65例ＡMＬ患者与15例正常人骨髓单个核细胞(MNC)MK、bcl-2mRNA的表达，并对20例AML患者和5例正常人采用NC中MK基因的表达。结果显示：初治组、复发组和化疗缓解组MK基因表达水平分别为0.331±0.436，0.374±0.463和0.067±0.190，正常人MK基因表达阴性；MK基因表达阳性与表达阴性患者的首次完全缓解（

2、CR）率分别为63.16%和93.55%（P=0.01），MK基因表达阳性患者的复发率（100%）明显高于表达阴性者（40%）（P=0.019）；多药耐药组与药物敏感组MK基因的表达率分别为57.69%和25.64%（P＜0.01）；MK与bcl-2基因表达呈正相关（r=0.556，P<0.001）。结论：AML患者白血病细胞可以产生MK，且MK阳性率的高低与AML病期相关，是影响AML患者近期预后的重要因素之一。MK可能通过上调bcl-2的表达抑制白血病细胞凋亡。【关键词】急性髓系白血病　　ExpressionofMidkineinPati

3、entsiaandItsSignificance　　AbstractThestudyedtoinvestigatetheexpressionofmidkine(MK)inbonemarroononuclearcells(BMMNC)from65acutemyeloidleukemiapatientsand15normalcontrols.ThemethodofRT-PCRinetheexpressionofMKmRNAinBMMNC.PartsofsampleseansofKpositivepatients（63.16%）aybeassocia-t

4、ediccellsisinducedbyupregulatingbcl-2expression.　　Keyyeloidleukemia；midkine；prognosis　　中期因子(midkine，MK)基因是近年来新发现的肝素结合性生长因子，其多种生物学活性与癌有关。近几年国外研究报道，MK在多种人类肿瘤组织中高表达，并参与肿瘤发病过程［1-3］。在髓系白血病细胞株中发现MK的异常表达，它可能参与白血病的发生、发展［4］。对AML患者表达情况的临床研究目前尚未有报道。我们分别应用RT-PCR和L患者MK基因与蛋白表达水平的变化，探讨MK表达与A

5、ML的近期预后和细胞凋亡的关系，推断其在AML发病中的可能作用。　　材料和方法　　病例　　65例AML患者包括50例初治患者，15例复发患者，15例健康志愿者作为正常对照。患者均符合FAB诊断标准［5］，其中M11例、M212例、M319例、M415例、M517例、M61例。男36例，女29例，中位年龄为32（14-64）岁。15例健康志愿者中男9例，女6例，中位年龄35（18-55）岁。髓系细胞株K562、HL-60由中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心提供。　　逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）　　应用TRIzoL提取BMMNC的总RNA，

6、然后逆转录成cDNA并进行PCR扩增。MK上游引物：5′-CCAGGCTTGGCGTCTAGT-3′，下游引物：5′-ATGCAGCACCGAGGCTTCCT-3′，扩增产物445bp。bcl-2的上游引物：5′-CAACATCACCTATTGGATCC-3′，下游引物：5′-CGGGTGTAGAGTCTCTCGCT-3′，扩增产物318bp。由对照GAPDH的上游引物：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGATA-3′，下游引物：5′-AGCCTTCTCCATGGTTGGTGAACAC-3′，扩增产物374bp。扩增条件：对MK，94℃

7、变性45秒，60℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，35个循环；对bcl-2，94℃变性60秒，61℃退火50秒，72℃延伸50秒，30个循环。对GAPDH，94℃变性40秒，55℃退火60秒，72℃延伸60秒，20个循环。取4μl扩增产物，同时加入4μlGAPDH扩增产物，经1.5%琼脂糖凝胶电泳（含溴化乙啶），90V，45分钟，EagleEyeⅡ读胶仪扫描定量，以MK/GAPDH、bcl-2/GAPDH的比值作为其mRNA相对表达水平。　　细胞孵育　　随机选取20例急性髓系白血病患者（包括复发患者2例，缓解期患者2例），5例正常人，分别无菌抽取骨髓

8、5ml，无菌条件下以淋巴细胞分离液（密度1.077）分离单个核细胞，用RPMI1640培养液洗2遍，以5×106/ml的接