大鼠皮层星形胶质细胞原代培养、鉴定及氧糖剥夺模型的建立

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1、大鼠皮层星形胶质细胞原代培养、鉴定及氧糖剥夺模型的建立作者：魏爱宣李昕华闫世军何金婷莽靖邢影邵延坤徐忠信【摘要】目的原代培养和鉴定大鼠皮层星形胶质细胞，并建立大鼠皮层星形胶质细胞氧糖剥夺(OGD)模型。方法大鼠星形胶质细胞原代培养后，作胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色鉴定，应用缺氧DHank液及缺氧培养罐行OGD后用台盼蓝染色及乳酸脱氢酶(LDH)漏出率检测细胞损伤程度。结果星形胶质细胞培养至第9天，GFAP染色阳性细胞为98.54%±2.01%;星形胶质细胞经不同时间OGD处理后，台盼蓝染色呈现不同形态;OGD60min时，星形胶质细胞LDH漏出率较对照组

2、明显增加(P<0.05)，并随时间递增。结论成功完成大鼠皮层星形胶质细胞原代培养，星形胶质细胞在培养第9天可用于模型制备，成功建立星形胶质细胞OGD模型。【关键词】星形胶质细胞;原代培养;氧糖剥夺(OGD)　　【Abstract】ObjectiveToconductprimarycultureandidentificationofratcerebralcorticalastrocytes,andtosetuptheoxygen/glucosedeprivation(OGD)model.MethodsCellspresentedintheculturemunocyto

3、chemistry,usingspecificantiGFAPantibody.OGDmodelberandidentifiedbycelldeathandLDHreleaserate.ResultsImmunohistochemistryofculturedcellshootilityidentifiedbytrypanbluestaine;60minOGDcausedasignificantincreaseonthelevelsofLDHrelease(P<0.05).ConclusionsTheprimarycultureastrocytescouldbe

4、exploredtoOGDatthe9thday.ThemodelofOGDischemiainastrocytesissuccessfullyestablishedbyhypoxicDHank′sandananaerobicchamber.　　【Keyaryculture;Oxygenglucosedeprivation(OGD)　　研究表明在缺血缺氧性脑损伤过程中，星形胶质细胞和神经元有着动态、复杂的相互作用，从而维持脑组织的正常功能和存活〔1～3〕。本实验采用大鼠皮层星形胶质细胞原代培养，应用体外氧糖剥夺(oxygenglucosedeprivation,OGD

5、)建立大鼠脑皮层星形胶质细胞缺血缺氧损伤模型，模拟体内脑缺血过程，为今后进一步探讨缺血过程中星形胶质细胞的脑保护作用机制奠定基础。　　1材料与方法　　1.1实验动物出生1～2d内的m3的小块，移入无菌锥底离心管内，加入胰酶，形成细胞悬液;于37℃，5%CO2培养箱中孵育、培养、传代备用。　　1.3大鼠皮层星形胶质细胞鉴定①细胞培养板每日置于倒置显微镜下观察细胞胞体与突起形态、贴壁与生长情况。②星形胶质细胞在培养第9天用胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotEin,GFAP)免疫细胞化学染色进行鉴定，显微镜下观察，以在细胞膜和胞浆内出现棕黄色颗

6、粒者判定为阳性，每张爬片随机选取3个200×视野，计数，取均值，计算阳性细胞百分比。　　1.4体外培养星形胶质细胞OGD模型的建立①利用自行设计、长春应用化学研究所生产的组装瓶和负压吸引装置将DHank液通入含95%N2及5%CO2的缺氧气体，制备缺氧DHank液，用血气分析仪测定缺氧DHank液的氧浓度。②将真空干燥器通入缺氧气体制成缺氧罐，用麻醉气体分析仪测定缺氧罐内氧含量。③将培养第9天的星形胶质细胞用缺氧DHank液孵育，并放入缺氧罐中，将缺氧罐放入37℃孵箱内开始计时;分别取缺氧时间为15、30、45、60、90、120、180min再复氧24h的星形胶

7、质细胞进行评价。　　1.5体外培养星形胶质细胞OGD模型的评价①台盼蓝染色法测定细胞死亡率。测定时取出培养板，每个时间点取3孔，吸弃上清液，然后加一滴0.4%台盼蓝溶液，在3min内随机计数200个细胞中蓝染的死细胞及未蓝染活细胞的细胞数，计算细胞死亡率。②LDH漏出率的检测。将待测细胞培养板　　取出，每组每个时间点取3孔，吸取各孔内的培养液入相应试管内，加入等量PBS液，制备成细胞匀浆液，收集入相应的试管内。每孔液体设2个试管，分别测定细胞培养液和细胞匀浆液的OD值。按公式计算LDH漏出率。　　1.6统计学分析数据以x±s表