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1、对氧磷酯酶亚型1对小鼠巨噬细胞的作用机制 大量流行病学调查表明，人群中可因PON1基因多态性、衰老、冠心病、糖尿病、代谢综合征等代谢性疾病因素出现血清PON1活性降低，以下是小编搜集整理的一篇探究对氧磷酯酶亚型1对小鼠巨噬细胞的作用机制的劳务费，供大家阅读参考。 对氧磷酯酶(Paraoxonase,PON)是一类钙依赖性的催化水解磷酸酯键的芳香酯酶,因其常见底物为对氧磷而命名。其包括PON1、PON2和PON3三种亚型,其中PON1主要由肝脏合成分泌入血、高亲和结合于高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein,HDL),是HDL发挥抗氧化及抗炎的主要成分。
2、大量流行病学调查表明,人群中可因PON1基因多态性、衰老、冠心病、糖尿病、代谢综合征等代谢性疾病因素出现血清PON1活性降低,我们前期的调研也认为,血清低PON1活性可作为评估冠心病事件发生及严重程度的一种危险标志。一系列实验研究也证实,PON1具有抗动脉粥样硬化的作用:PON1基因敲除(PON1geneknockout,PON1-/-)小鼠可观察到体内HDL更容易氧化,低密度脂蛋白(loornecrosisfactor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的合成和分泌,明显改善巨噬细胞的炎症氧化状态。尽管PON1确切的
3、作用底物及相关机制仍未彻底阐明,但其抗炎抗氧化活性显然对于抗动脉粥样硬化效应有重要意义。 因此,本研究拟构建含人源性PON1基因的慢病毒载体,旨在真核细胞高效表达分泌PON1,为进一步研究PON1的生理性底物、相关代谢性疾病的发生机制及临床诊治奠定基础。 1材料与方法 1.1主要材料与试剂人胚肾上皮293T细胞购于武汉大学典型培养物保藏中心;pEM培养基、胎牛血清、小牛血清购自Gibco公司;对氧磷(paraox-on)、巯基乙酸盐肉汤(thioglycollatebroth)为Sigma公司试剂;LDL购于ProSpec-Tany公司;蛋白Marker、核酸Marker、
4、磷酸钙转染试剂盒源于Pro-mega公司;RIPA裂解液购于碧云天生物技术研究所;PON1抗体、羊抗小鼠IgG为Abcam公司产品;ECL化学显影液购于Thermo公司;TNF-α、IL-6的酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购于eBioscience公司;其它试剂均为进口分装或国产分析纯。 1.2方法1.2.1pEM培养基,在37℃、5%CO2培养箱内培养,待密度至40%-50%且细胞生长状态良好时进行转染,转染前2h细胞换液(全培养基)。在两个无菌圆底试管中分别用500μl溶液准备预混的磷酸钙转染体系:管1含20μgDNA、62μl2mol/LC
5、aCl2;管2为2HEPES缓冲液(pH7.1),将管1溶液逐滴加入管2并涡旋震荡,室温孵育20min后,逐滴加入293T细胞培养板并混匀,12h后更换新的10%胎牛血清的DMEM培养液,分别于0,12,24,36,48及60h时间点用倒置荧光显微镜观察细胞绿色荧光表达情况,并收取0.2ml培养基,用于测培养基中PON1含量和活性。 1.2.3EM培养液进行原代细胞培养,24h后换为1ml新鲜无血清高糖DMEM培养基,同时加入2ml慢病毒载体瞬时转染293T细胞48h的培养基,氧化组以10mg/L氧化型LDL(oxidativeLDL,ox-LDL)[10μmol/LCu
6、2+与LDL1g/L,37℃共孵育24h,0.2mmol/LETDA(pH7.4)终止反应,透析,0.45μm过滤获得] 处理细胞建立氧化条件,细胞置于37℃、5%CO2温箱继续孵育,收集6h时各孔的条件培养液及RIPA裂解液处理的细胞,留做炎症因子的检测分析。 1.2.6ELISA法检测TNF-α、IL-6的水平培养基中TNF-α、IL-6水平的检测采用ELISA法按试剂盒说明进行,于酶标仪450nm处测量,每个样本重复3次。每孔细胞以Lon;s表示,采用SPSS16.0统计软件进行统计分析,两组间均数比较采用t检验,P<0.05表示差异
7、有统计学意义。 2结果 2.1pWPI-PON1重组慢病毒载体构建与鉴定利用引物设计、PCR法获得两端添加酶切位点的PON1基因,PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中可见约1kb处有明亮的DNA条带,与预期PON1条带基本一致(图1A)。 将纯化的PCR扩增产物与pWPI载体经酶切连接、转化后,筛选单菌落进行液体培养、提取质粒,经琼脂糖凝胶电泳初步鉴定大小后送检测序,测序结果证实第1、2号为构建成功的pWPI-PON1重组载体(图1B)。 2.2pWPI-PON1重组体瞬时高
