多种属cpgodn诱导特异性抗体反应的研究

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1、多种属CpGODN诱导特异性抗体反应的研究ok3munestimulationactivityofCpGoligodeoxynucleotidestodifferentspeciesanddevelopCpGoligodeoxynucleotidesthatpossessbroad-spectrumimmunestimulationactivity.MethodChickensandmicesofchickensandmiceice,andthelevelofantibodiesingroupsaderestrictivelypossesse

2、sbroad-spectrumimmunestimulationactivity.Keyultispeciesspecificity;vaccine包含CpG基序的人工合成的寡核苷酸(ODN)作为免疫刺激信号可以被动物的免疫系统所识别,随后CpGODN刺激人类和多种动物产生天然的和获得性的免疫应答。CpGODN主要通过TLR9活化免疫系统,产生Th1型免疫应答。因此,CpGODN作为佐剂已广泛应用于感染性疾病、肿瘤的预防和治疗[1]。但CpGODN存在种属特异性问题,这一问题限制了动物实验结论的外推性[2]。所以,寻找和开发具有广谱识别特性

3、的CpGODN具有重要的应用价值。本文主要通过观察鸡和小鼠血清中特异性抗体的变化来评价CpGODN对不同抗原的免疫增强效果,进而确定这种CpGODN是否能够克服物种限制性这一问题。1材料与方法1.1材料1.1.1动物健康1日龄小鸡,健康50日龄SPF鸡,购自广东省农科院;2月龄BALB/c小鼠,雌性,体质量20g左右,购自南方医科大学实验动物中心,合格证号:2003A074。1.1.2试剂10mg/mL猪囊虫抗原、猪囊尾蚴DNA疫苗VTS76、VR1020、CpGODN由本实验室保存[3,4],SPAHRP购自上海生物制品研究所。1.2动物

4、分组及免疫方案1.2.1鸡实验组取健康1日龄小鸡,随机分成A、B、C三个组,每组20只,各组饲养条件相同。7日龄时各组处理如下:A为对照组,不作任何处理;B组滴鼻免疫VTS76疫苗(100μg/kg);C组滴鼻免疫VTS76疫苗(100μg/kg),并同时颈部皮下注射免疫佐剂CpGODN(100μg/kg),21日龄时B、C组按相同的处理加强免疫1次。1.2.2BALB/c小鼠实验组BALB/c小鼠60只,随机分为3组,每组间隔2周免疫2次。采用肌肉注射法,将质粒DNA溶液注射到小鼠两侧股四头肌。A组注射VR1020100μg/kg作为阴性对

5、照;B组注射VTS76(100μg/kg);C组注射VTS76和CpGODN各100μg/kg。1.3抗原特异性抗体检测96孔培养板用碳酸氢钠缓冲液(15mmol/LNa2CO3,35mmol/LNaHCO3,PH9.6)适当稀释的猪囊虫抗原包被,4℃过夜孵育。用含Tol/LPBS,0.1%Tin;每孔加入100mL经PBS(0.1mol/LPBS,1%BSA)适当稀释的待测血清,37℃孵育2h。PBS洗涤5次,每孔加入100mL、1∶40稀释的SPAHRP,37°C孵育2h。PBS洗涤5次,每孔加入100mLTMB底物(含0.1mg/mL

6、3’3’5’5’四甲基联苯胺的磷酸盐柠檬酸缓冲液,pH5.4,用前加5mL30%H2O210mL),37℃孵育1h。每孔加入50mLH2SO4(0.2mol/L)终止显色反应。BioRad3550测定A450读数。待测样品A值大于阴性对照平均A值的3倍为阳性。1.4统计学分析各实验组数据比较均采用方差分析,P<0.05为差异有显着性。2结果2.1CpGODN对鸡血清中猪囊尾蚴特异性抗体滴度的影响C组在初次免疫1周后可以检测到特异性抗体,但抗体滴度很低;在初次免疫2周和二次免疫1周后,B组和C组特异性抗体滴度明显上升,且C组显着高于

7、B组(P<0.05);二次免疫后2周,B组还有明显上升,而C组已进入平台期,维持在一个较高的水平,两组之间差异无显着性(P>0.05)。对照A组在各个时间点均未检测到特异性抗体。以上结果表明,CpGODN能够显着增强VTS76疫苗诱导的体液免疫应答水平。见图1。图1免疫鸡特异性抗体滴度的动态变化(略)Fig.1Dynamicchangesoftitersofspecificantibodyagainstofimmunizedchickens2.2CpGODN对小鼠血清中猪囊尾蚴特异性抗体滴度的影响B组和C组在初次免疫1周后可以检测

8、到特异性抗体,但抗体滴度很低(1∶20)。二次免疫后1周,B组和C组免疫小鼠的抗体滴度均明显上升,但差异无显着性(P>0.05)。二次免疫后的第2周到第3周,