多药耐药铜绿假单胞菌MexABOprM主动外排系统的耐药作用与其调控基因mexR的突变情况

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1、·安徽医科大学硕士学位论文中文摘要目的1了解MexAB-OprM主动外排系统在本地区多药耐药铜绿假单胞菌中的耐药作用；2了解MexAB-OprM主动外排系统调控基因mexR的突变情况。材料与方法菌株来源收集2006年1月～2007年12月安徽医科大学第一附属医院临床标本中分离出的铜绿假单胞菌120株，经美国MicroScanWalkAWay-40全自动微生物分析仪鉴定（剔除来自同一患者的重复株）。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853购自卫生部药品生物制品检定所，大肠埃希菌(ECO)JM109为实验室保

2、存菌株，铜绿假单胞菌野生株（PA01）由上海华山医院馈赠。方法参照美国临床实验室标准化研究所（CLSI）用琼脂稀释法测定120株铜绿假单胞菌对14种常见抗菌药物的最低抑菌浓度，挑选26株多药耐药菌株和15株敏感菌株；基于SYBRGreenⅠ荧光探针技术，构建克隆载体pMD18-T-mexB和pMD18-T-16SrDNA作为标准品，采用实时荧光定量PCR法检测MexAB-OprM主动外排系统内膜转运蛋白MexB的结构基因mexB和内参照基因16SrDNA的mRNA水平；联合L-酚丙氨基-L-氨基酰-ß-萘胺（MC-207,110）和

3、环丙沙星（CIP），测定26株多药耐药铜绿假单胞菌的MIC，筛选外排表型阳性的铜绿假单胞菌；用2····安徽医科大学硕士学位论文PCR扩增外排表型阳性菌株的MexAB-OprM主动外排系统调控基因mexR并对其产物测序，结果经Blast比对，判断其突变情况。结果120株铜绿假单胞菌中有26株对这14种常用抗菌药物全部耐药，有15株对这14种常用抗菌药物全部敏感，野生株、多药耐药菌株和敏感菌株均检测出mexB的mRNA基因，经统计学分析，多药耐药菌株的mexBmRNA水平（2.41±1.10）显著高于敏感菌株（1.47±0.83）（P

4、＜0.01）。联合MC-207,110后有20株多药耐药铜绿假单胞菌（76.9%）对CIP的MIC值下降4倍及以上，其中有15株mexR基因发生变异，13株发生点突变，出现氨基酸替换，2株发生插入突变，导致氨基酸插入，点突变位点是336G-A，603G-A，660G-A，584C-G，653T-A，后两者导致氨基酸替换103Ala—Gly126Val—Glu，插入突变是在470和474核苷酸间插入碱基GGC，导致66和68氨基酸间插入Ala。结论MexAB-OprM主动外排系统表达水平的增高与本地区铜绿假单胞菌多药耐药的形成密切相关

5、，其调控基因mexR发生突变是其高表达的原因之一。关键词铜绿假单胞菌；耐药性；主动外排；MexAB-OprM3····安徽医科大学硕士学位论文ThecontributionofMexAB-OprMactiveeffluxsysteminmultidrugresistantpseudomonasaeruginosaandmutationofmexRAbstractObjectiveTostudythecontributionofMexAB-OprMactiveeffluxsysteminmultidrugresistantpseudo

6、monasaeruginosaandmutationofmexR.MaterialsandmethodsIsolates120clinically-isolatedpseudomonasaeruginosawerecollectedfromJanuary2006toDecember2007inTheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity.TheywereidentifiedbyMicroScanWalkAWay-40analysator.MethodsStandardagard

7、ilutionwasusedtodeterminetheminimalinhibitoryconcentration(MIC)of120strainsofPseudomonasaeruginosaisolatedclinically.The26strainsofmultidrugresistantpseudomonasaeruginosaandthe15strainsofsusceptiblesusceptiblepseudomonasaeruginosawereselected.BasedonfluorescentSYBRGree

8、nⅠmethodology,twocloningvectorspMD18-T-mexBandpMD18-T-16SrDNAwereconstructedasstandardplasmids.ThelevelsofmexBmRNAof1