人正常食管黏膜上皮细胞的纯化分离和传代培养

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1、人正常食管黏膜上皮细胞的纯化分离和传代培养作者：张茹，龚均，王晖，王利，雷娟，冉力伟【关键词】细胞培养Isolationandsubcultureofhumanesophagealsquamousepithelialcells　　【Abstract】AIM:Toinvestigatetheoptimalmethodforthecultureofhighlypurifiedhumannormalesophagealepithelialcellsandtoyieldsignificantcellnumbers.METHODS:Cellstissuesbydispased

2、igestionandtrypsinizationandthenprimarilyculturedandsubculturedinserumfreekeratinocytemedium(KSFM)orfetalbovineserum(FBS)supplementarymedium(KSFMl/LFBS).Thebiologicalcharacteristicsofthecellsentsandgroedimmunohistochemicallyusingantihumanmonoclonalantibodyofthecytokeratin14(CK14),cytok

3、eratin13(CK13)andvimentin.RESULTS:Fibroblastse(PDT)inKSFMl/LFBS.TheadherentcellssignificantlyincreasedinKSFM（P<0.01）.ThepercentagesofCK14positivecellsinKSFMeinthese2kindsofmedia.Contrarily,thepercentagesofCK13positivecellsentinannormalesophagealsquamousepithelialcellsproductivelyinv

4、itro,dispasedigestionandserumfreekeratinocytemediumarefeasibleandcrediblemethods.Serummayinducethedifferentiationofthesells.　　【Keyl/L胎牛血清的培养基中的细胞生长曲线和贴壁性；采用细胞角蛋白14、13(CK14,CK13)和波形丝蛋白抗体三者共同鉴定细胞.结果：细胞倍增时间在KSFM中为（51.5±11.5）h(n=3)，而在含100ml/L血清培养基中不能计算；在KSFM中，贴壁细胞明显为高（P<0.01）；CK14阳性细胞百分

5、率KSFM组在不同时段均高，但两组内均随生长时间增加而减少；CK13阳性细胞则恰与其相反；两组中均未见波形丝蛋白阳性表达.结论：Dispase消化分离细胞，KSFM作为培养基是食管鳞状上皮可靠的新培养方法.　　【关键词】食管；上皮细胞；细胞培养　　0引言　　目前食管黏膜的传代培养，就报道的极少的几种方法还存在着很多问题，比如大量的成纤维细胞污染［1］，不能传代扩增或传代次数较少［2］，细胞数量较少.我们通过改善原代取材时消化方法，进行含血清及不含血清培养基比较研究，探讨出能获得大量细胞的新的正常食管黏膜细胞的培养方法.　　1材料和方法　　1.1材料　　人角朊细胞培养

6、液（KSFM,Gibco），胰酶（Sigma）,DMEM(Hyclone),Dispase(Gibco)，胎牛血清（杭州将滨生物技术有限公司）.SP免疫组化染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，单可隆抗体细胞角蛋白14、13（CK14,CK13）和波形丝蛋白(vimentin)抗体购自上海长岛生物有限公司.从3例新鲜（仅离体数分钟）食管手术标本上选取正常黏膜标本，浸入4℃PBS中，当日即进行原代培养.标本获取均经患者同意，并签订同意书.　　1.2方法　　将食管黏膜组织放入添加20万u/L青霉素、200mg/L链霉素和1.5g/L庆大霉素的PBS中充分洗涤到无血

7、迹后，洗必泰消毒，后依次采用如下方法消化分离获取黏膜细胞.4℃条件下标本在2.5g/L中性蛋白酶（dispase）中消化18~24h后，用眼科镊将黏膜层撕下，放入2.5g/L胰酶中，37℃消化5～10min.其后加入等量的含100mL/L胎牛血清的DMEM终止消化，吹打，成单细胞液，离心，PBS清洗后接种.静置于37℃，50mL/LCO2培养箱中，24~48h后观察细胞贴壁情况，弃取原培养基，其中含未贴壁细胞，加入新鲜培养基后继续培养.上皮细胞铺满培养皿底的75%，加EDTA的2.5g/L胰酶消化后可传代.设无血清培和含血清两种培养基进行对照观察［3,4］.无血