猪脑心肌炎病毒非结构蛋白2c的原核表达与间接elisa方法的建立

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1、摘要猪脑心肌炎是由脑心肌炎病毒（encephalomyocarditisviurs，EMCV）引起猪的 以脑炎、心肌炎或心肌周围炎为主要特征的急性传染病。本研究针对EMCV非结 构蛋白2C基因设计合成了一对特异性引物，通过RT-PCR获得了长为1062bp的 2C基因序列，构建了重组原核表达质粒pGEX-6P-2C，并在大肠杆菌BL21细胞中 成功表达了62ku预期大小的重组2C蛋白，蛋白表达量约为33.9％。重组2C蛋白 于室温保存72h，-20℃和-80℃分别保存12月，冻融9次未见降解。Westernblot 分析表明，重组2C蛋白可以被猪源或兔源抗EMCV阳性血清识别。

2、以纯化的重组2C蛋白作为包被抗原建立了检测EMCV抗体的间接ELISA方法，确定了方法的最佳工作条件和阴阳性临界值，检测了方法的特异性、敏感性、重复性，并用该方法分析了EMCV感染动物2C抗体的产生动态。试验结果表明， 间接ELISA的阴阳性临界值为0.27，以1µg/mL的重组2C蛋白于37℃包被1h后 4℃过夜，用含5％小牛血清的PBST于37℃封闭1h，待检血清作1׃20倍、酶标二 抗作1׃400倍稀释后分别于37℃反应1h和45min后，加底物后于室温避光显色15 min为最佳工作浓度和工作条件。重组2C抗原与猪抗CSFV、PCV2、PPV、PRV 和PRRSV等5种阳

3、性血清不发生交叉反应，EMCV可以阻断重组抗原与脑心肌炎 阳性血清的特异性反应。该ELISA方法与血清中和试验的符合率为95.7％（22/23）， 相对敏感性为90.9％（10/11）；同一时间批内重复性试验的变异系数＜10％，不同 时间批间重复性试验的变异系数＜15％。应用该方法可以在EMCV感染仔猪后4d， 检测到相应抗体，感染后7d抗体水平最高，随后逐渐下降，直至感染后21d仍然 可以检测到较低水平的2C抗体。应用建立的间接ELISA方法检测了2006~2008年间河北省不同地区31个规模 化猪场的1306份血清样本。结果显示，EMCV抗体阳性率平均为13.48％，其中经

4、 产母猪的抗体阳性率最高（27.68％），其次为后备母猪和哺乳仔猪（分别为16.67 ％和2.86％），育成猪EMCV抗体阳性率最低（1.98％）。上述研究结果表明，重组EMCV2C蛋白具有良好的稳定性和反应原性；以其 作为包被抗原，建立的间接ELISA方法可以用于猪脑心肌炎的早期诊断和血清流行 病学调查；河北省猪群中存在EMCV感染现象，尤以经产母猪的感染率最高。关键词：EMCV；2C基因；克隆；原核表达；ELISA；血清学调查AbstractPocrineencephalomyocarditisisanacuteinfectiousdiseaseofswinecausedb

5、y encephalomyocarditisvirus（EMCV）andcharacterizedbyencephalitis,myocarditisor inflammationaroundcardiacmuscles.Inthisstudy,first,apairofspecificprimerto EMCVnonstructuralprotein2Cgenewasdesignedandsynthesizedand2Cgene sequenceof1062bpwasobtainedbyRT-PCR.Moreover,recombinantexpression plasmid

6、pGEX-6P-2Cwasconstructedandpredictedrecombinantnonstructuralprotein 2Cof62kuwasexpressedinE.coliBL21cellsattherateofabout33.9%.Novisible degradationwasfoundwhenrecombinantprotein2Cwaskeptinroomtemperaturefor 72h,-20℃and-80℃for12months,orwhenitunderwentfreeze-thawingfor9times. AndWesternblott

7、ingshowedthatrecombinantprotein2Ccouldberecognizedby positivepigorrabbitanti-serumtoEMCV.Second,anindirectELISAwasdevelopedtodetectantibodyagainstEMCVwith purifiedrecombinantprotein2Cascoatingantigen,reactionconditionandworking concentrationsoptimi