脯氨酸含量的测定

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1、植物组织游离脯氨酸含量的测定（一）实验原理     植物在逆境条件下，游离脯氨酸便会大量积累，且积累指数与植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。     采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减少了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态(干或鲜样)限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。 （二）实验材料、仪器设备及试剂 1材料植物叶片     2仪器设备 分光光度计，恒温水浴锅，漏

2、斗，具塞刻度试管(20ml) ，移液枪（1ml和5ml），5ml和1ml刻度试管，烧杯，吸水纸，玻璃棒，试管架，比色皿等。3试剂 (1)3％磺基水杨酸溶液 ：万分之一电子天平称取3g磺基水杨酸，然后将称好药品溶于100ml蒸馏水中。    (2)甲苯 (3)2.5％酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6molL-l磷酸以3:2混合，作为溶剂进行配制，此液在4℃下2～3天有效（此步骤重要）。 称取1.25g茚三酮放入烧杯中用混合液50ml放入70℃水浴锅中溶解，冷却。(4)脯氨酸标准溶液：准确称取25mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为

3、100ug/ml。再取此液10ml，用蒸馏水稀释至100ml，即成10ug/ml的脯氨酸标准液。  三．实验方法1标准曲线制作 （1）取7支具塞刻度试管按表2加入各试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热40min。试管号0123456脯氨酸标准溶液/ml00.20.40.81.21.62水/ml21.61.20.80.40.20冰乙酸/ml2222222茚三酮显色液/ml3333333脯氨酸含量/µg0248121620（2）取出冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管作为对照在波长520nm下比色。

4、 （3）以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程 。2样品测定     （1）脯氨酸提取：从-80℃冰箱中取出样品，放入事先装好液氮的保温桶中。每个样品均取0.2g左右，分别置于大试管中，加入5ml 3％磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提10min。 （2）取出试管，待冷却至室温后，吸取上清液2ml，加2ml冰乙酸和3ml显色液，于沸水浴中加热40min，下步操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取和比色（向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管作为对照在波长520nm下比

5、色）。  （3）结果计算：从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度 脯氨酸含量的百分数。     脯氨酸[μg.g-1(干或鲜重)]=(C·V)·(a·W)－1    式中：C一提取液中脯氨酸浓度，由标准曲线求得：           V － 提取液总体积（ml）           A ---  测定时所吸取得体积（ml）           W----- 样品重（g）数据统计表海拔处理编号吸光度标准曲线斜率稀释倍数提取液中脯氨酸含量C（ug）提取液总体积V（ml）测定时所吸取的体积a（ml）样品重（W）脯氨酸含量ugg平均值2900CK11

6、1112113114PEG1211221231243000CK211212213214PEG2212222232243100CK311312313314PEG3213223233243258CK411412413414PEG4214224234243600CK511512513514PEG5215225235243600--1CK611612613614PEG6216226236243700CK711712713714PEG7217227237243800CK811812813814PEG8218228238243900CK91191291

7、3914PEG9219229239244000CK1011101210131014PEG10211022102310244100CK1111111211131114PEG11211122112311244200CK1211121212131214PEG1221122212231224