髓核细胞诱导骨髓间充质干细胞的分化和永生化的分析

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1、华中科技大学博士学位论文摘要第一部分：利用抽吸法诱导兔椎间盘椎退变模型目的:探讨利用抽吸法构建兔椎间盘退变模型，并观察其病理及影像表现。方法:10月龄健康新西兰大耳白兔28只，对照组7只，实验造模组21只。利用21G皮肤穿刺针分别在造模组兔L4/5单节段刺入，抽吸髓核越0.008~0.012g。造模完毕，实验兔继续培养4-20周。造模前后利用，X-ray平片、MRI及Alcianblue组织染色观察退变椎间盘的变化。结果:造模前后退变椎间盘高度指数百分比（DHI%）：对照组、4周组、12周组、20周组分别为(100±0)%、(

2、81±3.2)%、(75±2.5)%、(71±1.8)%(P<0.05)。退变椎间盘T2加权像信号明显降低，Alcianblue组织染色显示退变椎间盘组织中聚集蛋白多糖含量明显降低。结论:抽吸法构建兔椎间盘退变模型简便可靠，其退变过程的病理及影像表现与人椎间盘退变过程的病理及影像表现十分相似，该退变模型可用于人椎间盘退变的机制与临床治疗研究。【关键词】:抽吸法;椎间盘退变;动物模型；病理表现；影像学表现第二部分：髓核细胞对骨髓基质干细胞的诱导作用目的:探讨在藻酸盐微球的介导下，髓核细胞与骨髓间充质干细胞(bonemarrows

3、tromalcells,BMSCs)非接触性共培养时,髓核细胞对骨髓间充质干细胞的诱导作用。方法:①4月龄健康新西兰大耳白兔5只，取髓核细胞与骨髓间充质干细胞原代培养，利用传代法分离纯化；②将纯化的骨髓间充质干细胞经胰蛋白酶消化、收集，并与适量的藻酸钠溶液混合，形成106个/ml的单细胞悬液，将混合好的单细胞悬液经注射器滴加至3.5％的CaCl2溶液中，形成海藻酸钙凝胶珠；③将海藻酸钙凝胶微球与髓核细胞共培养。在7天和15天时，分组溶解海藻酸钙凝胶珠，收集骨髓间充质干细胞，分2华中科技大学博士学位论文别利用免疫组化技术、rt－

4、PCR技术和Westernblot技术检测骨髓间充质干细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达，用以判断髓核细胞对骨髓基质干细胞在非接触条件下的诱导作用。结果:在骨髓间充质干细胞的细胞爬片免疫组化染色中可见，细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖染色阳性，rt-PCR和Westernblot结果显示经诱导后骨髓间充质干细胞中已有Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖基因的表达，且诱导15天组的目的条带明显亮于诱导7天组的目的条带。结论:在体外非接触共同培养时,髓核细胞能够实现对骨髓基质干细胞的诱导作用，将骨髓基质干细胞分化为髓核细胞，这必将为椎间盘退行性变的移

5、植治疗提供可靠的种子细胞来源。【关键词】:骨髓基质干细胞;髓核细胞;藻酸钠微球；非接触共同培养第三部分：骨髓间充质干细胞向类髓核细胞的分化及永生化目的：尝试利用共培养法和SV40Tag永生化基因导入法构建一种来源于骨髓基质干细胞（MSCs）的永生化型类髓核细胞。方法：取实验白兔原代MSCs和髓核细胞（NPCs），荧光标记NPCs；将标记的NPCs与MSCs直接共培养6、9、12、15、18天；共培养完毕，利用流式细胞仪分选出荧光标记阴性细胞，即MSCs；观测共培养后MSCs细胞形态变化，检测胞内II型胶原和聚集蛋白多糖mRNA

6、及蛋白的表达变化；共培养15天时，将含有SV40Tag永生化基因的pCMVSV40T/PUR质粒转染MSCs，利用MTT法观测转染后MSCs增殖活性。结果：共培养后，MSCs胞内表达大量的II型胶原和聚集蛋白多糖，细胞形态也从长椭圆形变为多角形；当共培养15天时，胞内II型胶原和聚集蛋白多糖mRNA表达浓度达到最大值，但低于原代NPCs胞内II型胶原和聚集蛋白多糖mRNA含量（P<0.05）。导入SV40Tag基因后，MSCs-SV增殖能力与原代NPCs相同，传代20次后其增殖能力无衰退（P<0.05）。3华中科技大学博士学位

7、论文结论：利用共培养法和SV40Tag永生化基因导入法可构建出一种来源于MSCs的永生化型类髓核细胞；该类髓核细胞可能会对椎间盘退变的细胞移植治疗研究起到一定得帮助作用。【关键词】：共培养；骨髓间充质干细胞；髓核细胞；永生化4华中科技大学博士学位论文ABSTRACTPartI：ThePathologyandImagingPerformanceofRabbitDiscDegenerationModelInducedbytheAspirationofNucleusPulposusObjective:Toinvestigatethe

8、useofliposuctiontobuildrabbitmodelofdiscdegenerationandtoobservetheperformanceofitspathologyandimaging.Methods:Healthy10-month-oldNewZeala