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《王不留行中抑制血管生成的活性物质研究 》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、王不留行中抑制血管生成的活性物质研究花慧冯磊张小平张莲芬金坚【摘要】目的分析王不留行中具有抑制血管生成的活性成分。方法分别在体外培养人微血管内皮细胞(HMEC)和体内鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型的实验指导下，从王不留行中分离得到两种成分，用化学与光谱分析法鉴定其化学结构。结果这两种活性成分分别为王不留行环肽A，E。结论王不留行中抑制血管生成的活性成分是王不留行环肽A，E。【关键词】王不留行环肽王不留行环肽A，E血管生成王不留行系石竹科麦蓝菜Vaccariasegetalis(Neck)Garcke的干燥成熟种子,为传统常用中药,
2、有行血通经,催生下乳,消肿敛疮等功效。其植物资源丰富,除华南外,全国各地均有分布,尤以河北产量最大〔1〕，据报道其含有生物碱、黄酮、皂苷及环肽类等成分。本文在抑制HMEC增殖活性实验和鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验的指导下，对王不留行进行了系统地提取分离，最终得到两种活性较高的成分，结构鉴定为王不留行环肽A、E。首次发现王不留行中环肽A，E具有抑制血管生成的作用。 1器材 1.1材料与仪器AKTAexplorer100液相系统(Amersham公司)；SRB(Sigma公司)；MCDB-131细胞培养基(GibcoBRL公司
3、)；胰酶、小牛血清、L-谷氨酰胺(华美生物工程公司)；D4000型液质联用仪(odel3110细胞培养箱(Thermo-Forma公司)；MK3型酶标仪(Thermo-Lab-Systems公司)；王不留行药材购自江苏省无锡市山禾药业股份有限公司，南京中医药大学陈建伟教授鉴定为Vaccariasegetalis(Neck)Garcke。受精黄皮种蛋购自无锡马山种鸡场。 1.2细胞株人微血管内皮细胞(HMEC)由法国国家卫生医药研究院U553研究所(INSERMU553)陆核教授馈赠，保存于液氮罐中。 2方法 2.1样品提取
4、与分离在体外抑制HMEC增殖活性实验指导下，按以下步骤进行分析：将5kg王不留行水煎煮两次，提取液静置，离心，去沉淀，上清液经D-101型大孔树脂柱，依次以水，30%乙醇，50%乙醇，75%乙醇洗脱。收集75%乙醇洗脱液，回收浓缩至无乙醇味，再用正丁醇萃取，取正丁醇萃取物经反相Resource柱分离，CH3梯度洗脱得到组分A（16.8mg,tR＝35min)和组分B（24mg,tR＝42min)。 2.2细胞培养 将HMEC用含1mmol/L谷氨酰胺、1mg/L氢化可的松、10μg/LEGF和150ml/L小牛血清的MCDB-
5、131培养液,于37℃，50ml/LCO2培养箱中传代培养。 2.3SRB实验参照Skehan等〔2〕报道的SRB方法测定组分A、B对HMEC增殖的抑制率。取对数生长期细胞，按每孔7000～8000个细胞接种于96孔板中放置于37℃，50ml/LCO2的培养箱中培养过夜，加入不同浓度的组分A、B，以不加药组为阴性对照培养72h。去上清液,每孔轻轻加入100g/L三氯醋酸100μl固定,静置5min后移到4℃再放置1h倒掉固定液,用去离子水洗5次,空气干燥。每孔加入4g/LSRB100μl室温放置30min，用10ml/L醋酸液
6、洗5次，加入150μl10mmol/LTris碱液(pH10.5)溶解，用MK3型酶标仪在波长A570处测定每孔A值。计算抑制率(%)同时绘制药物浓度抑制率曲线,求出半数细胞抑制浓度(IC50)。抑制率（%）=〔(对照组的A值-药物组的A值)/(对照组的A值-空白组的A值)〕×100%。 2.4CAM血管生成实验受精黄皮种蛋， 2.5组分A、B的液质联用分析 2.5.1液相色谱条件色谱仪：EC-1体外增殖的抑制作用（略） 3.1.2组分A，B抑制CAM新生血管的形成CAM血管抑制试验是一种被广泛应用的体内血管抑制模型。本
7、实验发现生理盐水阴性对照组CAM血管生成非常明显，血管在药膜下呈放射状生长，血管粗大，血液充盈血管分支较多，毛细血管密度大。组分A，B则明显抑制了血管生成，放射状生长的血管数目大为减少，血管主要以零星、杂乱、叶脉样等表现形式存在，血管细小，稀疏，血管分支少，在药膜片下及周围局部鲜有血管区，或者血管断裂或消失，结果如图2所示。 图2组分A，B对CAM新生血管生成的影响(10×)（略） 3.2结构鉴定 3.2.1组分A白色粉末状，可溶于甲醇，难溶于水。分子式为C31H43O6N7，ESI-MSm/z610〔M+H〕+，511,
8、414,315,258IR（KBr）cm-13332,3234,1656,1631。氨基酸水解含有甘氨酸、酪氨酸、颉氨酸、脯氨酸、亮氨酸、色氨酸。以上数据与文献〔4，5〕报道一致，故组分A鉴定为：segetalinA。 3.2.2组分B白色结晶状，可溶于甲醇，
