虾肉中呋喃它酮代谢物化学发光酶免疫研究方法建立

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1、虾肉中呋喃它酮代谢物化学发光酶免疫研究方法建立1引百呋喃它酮是一种人工合成的硝基呋喃类抗生素，主要用于畜禽和水产动物的各种肠道感染性疾病的治疗及促进生长的添加剂，曾经在畜禽水产养殖中广泛应用。有关研究证明，呋喃它酮及其代谢物5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基酮（AMOZ）具有相当大的毒性和副作用，能诱导有机体基因突变及致畸胎，且能诱发癌症[1，2]。美国、加拿大、中国和欧盟的很多国家都已规定动物源性食品中呋喃它酮及其代谢物AMOZ残留为不得检出。但是因为其价格低廉、疗效好，目前违法使用现象在很多国家仍然存在，故有必要对动

2、物源性食品中呋喃它酮及其代谢物AMOZ加强监控[3]。由于咲喃它酮1原药不稳定，进入动物体内后会被迅速代谢和分解，对原药的检测难度很大，但其代谢物AMOZ可以蛋白结合物的形式长期、稳定存在组织内，在适当的酸性条件下，这些结合残留物可以从蛋白质中释放出来，因此通常将AMOZ作为监测呋喃它酮的靶化合物[1，4,5]。目前，AMOZ检测方法主要有色谱法[6〜9]、免疫分析法[10]等。色谱法准确、灵敏，但操作复杂、设备昂贵、检测速度慢，需要专业技术人员。而免疫分析法具有简单、快速、灵敏度较高、特异性强和高通量等优点。免疫分析法的

3、关键是高亲和力和特异性的抗体的制备，其中基因工程重组单链抗体是将天然抗体的重链可变区VH和轻链可变区VL通过一条柔软的连接肽连接成的单链分子，不仅具有高亲和力和特异性，而且还可以通过工程菌发酵快速大量制备，极大地降低了抗体生产成本，缩短了抗体生产周期。化学发光免疫分析是近十年来发展起来的一项将高灵敏度的化学发光与高特异的免疫分析相结合的新兴的免疫检测技术，具有检测特异性好、检测范围宽、操作简单自动化程度高等优点，能显著提高检测的灵敏度，并且比常用的其他免疫分析法的灵敏度都高[11〜14]迄今为止，文献报道的AMOZ免疫分析

4、法都是建立在传统的多克隆或单克隆抗体基础上的ELISA法，利用重组单链抗体建立的AMOZ化学发光酶免疫分析方法还未见报道。本研究利用重组抗AMOZ衍生物单链抗体，建立了测定虾肉中AMOZ残留的间接竞争化学发光酶免疫分析新方法。本方法简便、快速、准确、仪器设备简单，灵敏度高于ELISA法，测定结果和HPLC-MS/MS法测定结果呈现良好的相关性。2实验部分2.1仪器与试剂WallacVictor31420多标记分析仪（美国PerkinElmer公司）；WellwashMK2洗板机（美国Thermo公司）；96孔化学发光检测板

5、条（厦门云鹏生物公司）；1200-6410A型HPLC-MS/MS联用仪（美国Agilent公司）;5417R台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；JY92-IIN型超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；超滤浓缩设备（美国Millipore公司）；DK-8D型电热恒温水槽（上海医用恒温设备厂）；WH-1微型漩涡混合仪和90-2型定时恒温磁力搅拌器（上海沪西分析仪器厂）；MF1-A10超纯水仪（美国Millipore公司）。化学发光底物液（美国Pierce公司）；抗His标签抗体和羊抗鼠IgG-HRP

6、（武汉博士德生物工程有限公司）；呋喃它酮、AMOZ、NPAM0Z以及其它硝基呋喃类抗生素及其代谢物标品（美国Sigma公司）；含有PET22b（+）-AMOZ质粒的抗AM0Z衍生物单链抗体阳性克隆菌，由本研究室构建并鉴定；AM0ZA-0VA包被原也由本研究室制备，并经质谱和全波长扫描鉴定；其它试剂均为国产分析纯或色谱纯；刀额新对虾（Metapenaeusensis）样品（购于当地农贸市场）。