实验二根系活力的测定a萘胺氧化法

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1、实验二、根系活力的测定——a-萘胺氧化法植物生物学实验(二)植物生理学基础与综合实验南京师范大学生命科学学院一、实验目的了解根系活力的生理意义；掌握a-萘胺氧化法测定根系活力的原理与方法。了解植物生理学实验设计中的一些注意事项。二、实验原理（一）植物根系的生理功能:吸收：水分、无机盐、CO2。输导固着合成贮藏根系吸收无机盐的过程：部位：根尖，根毛区最活跃。步骤1，呼吸释放CO2；2，形成H2CO3；3，H+与HCO3-吸附在根表面。4，溶液中阴阳离子分别与HCO3-、H+交换。5，吸收，进入根内部。6，运输。根系活力即根的生长情况和代谢水平。它直接影响植物地上部的生长和营养

2、状况以及产量。植物根系中的过氧化物酶能氧化α-萘胺，生成红色的α-羟基-1-萘胺，并沉淀于根表面，将根系染成红色。一般来说根呼吸强度越大，即该酶的活力越强，对α-萘胺的氧化力也越强，染色也越深。可以根据根系表面着色深浅，定性观察并判断根系活力大小，也可通过测定溶液中未被氧化的α-萘胺的量，以定量测定根系活力。（二）根系活力的意义与测定方法定性观察根系表面红色越深，说明根系活力越强。定量测定剩余的α-萘胺在酸性环境中可与对氨基苯磺酸（sulfanil-amide）和亚硝酸盐作用生成稳定的红色偶氮染料。定量测定对-苯磺酸-偶氮-α-萘胺生成的红色偶氮化合物在pH7.0时在510

3、nm处有最大吸收峰，可用分光光度法测定光吸收值，从而利用此反应来间接测定溶液中α-萘胺的量。注意：OD510越大→α-萘胺剩余越多→根系活力越弱反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。三、实验材料与仪器设备（一）实验材料水稻(OryzasativaL.)等水生植物的须根系。（二）仪器与用品分光光度计、天平、恒温培养箱、三角烧瓶、量筒、移液管、剪刀、玻棒。（三）试剂α-萘胺溶液：先用少量的95%酒精溶解，然后加水定容成。配制50μg/mL、50μg/mL溶液。0.1

4、mol/L磷酸缓冲液，pH7.0。1%对氨基苯磺酸溶液：溶解于30%的醋酸溶液中。0.01%亚硝酸钠溶液。四、实验步骤（一）定性观察：处理：挖取处于不同生长状态的须根系植株（如水稻、豌豆苗根系等）数株，洗净根部后再用滤纸吸去根上附着的水分。2.观察将植株根系浸入盛有25μg/mLα-萘胺溶液并用黑纸包裹的容器中，静置24-36小时后观察根系着色情况。比较不同植株根系活力大小，并与植物生长势比较，分析植物生长势与根系活力之间的关系。（二）定量测定取50μg/mL的α-萘胺溶液和0.1mol/LpH7.0的磷酸缓冲液各25mL，置于三角瓶中，混匀。称取根系2g浸没于三角瓶中的溶

5、液中。同样地，取50μg/mL的α-萘胺溶液和0.1mol/LpH7.0的磷酸缓冲液各25mL，置于另一三角瓶中，混匀，不放根系作为对照。1、实验处理2、实验初始值测定5min后，分别从两瓶中各取2mL溶液，按照步骤4作第一次测定。记录OD（实验组）与OD0（对照组）。3、实验终了值测定将两三角瓶置于25℃恒温箱中避光保温60min后，各取2mL，按照步骤4作第二次测定。记录OD’（实验组）与OD’0（对照组）。4、a-萘胺含量测定取2mL培养液加10mL水混匀，再顺次加入1mL对氨基苯磺酸溶液与1mL亚硝酸钠溶液，混匀，观察溶液颜色变化，再定容至25mL。室温25min后

6、，于510nm处测定吸光度（OD）值。5．标准曲线制作：以50μg/mL的α-萘胺溶液为母液，配置40、30、20、10、5、0μg/mL的溶液各10mL。各取2mL，按照步骤4分别反应，并测定OD值。以OD值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制α-萘胺溶液的标准曲线。或者根据浓度与OD值关系直接计算回归方程。6．换算浓度分别查对标准曲线，或利用回归方程直接计算出实验组与对照组溶液实验前后对应的α-萘胺浓度（C、C’与C0、C’0）。7．计算根系活力根据实验结果计算不同植株根系对α-萘胺的生物氧化强度（mgα-萘胺/gFW·h），并与植物生长势比较，分析它们之间的关系。-萘胺生物

7、氧化强度=48mL×（C-C′）-48mL×（C0-C0′）2g×1h五、思考题为什么利用a-萘胺氧化法测定植物的根系活力时需要在5min后作第一次测定？测定根系活力时最好选择根的哪个部位？为什么？3.简述分光光度计使用过程及注意事项。4、在使用分光光度计时，为什么每改变一次波长，就需要重新调零和调透光率100%？5、为什么在测定时需要洗净比色皿？洗净的比色皿在倒入提取液时为什么还要用提取液洗2-3遍？