SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验教学尝试.doc

《SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验教学尝试.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、“SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳”实验教学尝试杜伟（江苏省邳州市第二中学221300）摘要：学生不受传统实验的限制，在教师的指导下查资料、设计实验步骤、选择实验器材进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，得到了清晰的电泳图谱。关键词：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、开放性实验、电泳图谱蛋白质电泳作为分子生物学研究的基本技术出现在人教版高中生物选修1中（选做），但由于实验条件和技术的限制，许多中学无法开设此实验。为了培养学生实验动手能力，让他们更好的理解蛋白质电泳的知识，充分体会参与科研实验的乐趣，为以后的科学研究打下坚实的基础，并为其他学校开设该实验

2、提供借鉴。我们对SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验进行了认真的研究，指导生物兴趣小组同学进行开放性实验。1实验准备(1)实验材料：低分子量蛋白质标准，购自宝生物工程(大连)有限公司。(2)学生在教师的指导下查资料、设计实验步骤、选择实验器材。2实验过程(1)溶液与缓冲液的配制学生查阅资料，寻找①30%丙烯酰胺单体贮液；②分离胶缓冲液贮液（1.5mol/LTris-HCl，pH8.8）、浓缩胶缓冲液贮液（1.0mol/LTris-HCl，pH6.8）；③10%SDS、10%过硫酸铵、电泳缓冲液、染色液、脱色液配置方法。在教师指导下，完成上述缓冲

3、液配制。(2)SDS-PAGE电泳学生在教师的指导下完成以下实验过程：步骤学生活动教师指导1玻璃板洗净，晾干后小心加入封条，装在垂直电泳槽上，将玻璃板固定好。固定玻璃板时两面用力要均匀，防止夹坏玻璃板，同时应夹紧，防止漏水。2制作12%分离胶：在专用烧杯中加入30%丙烯酰胺贮液4.0mL；双蒸水3.3mL；1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）2.5mL；10%SDS100μL；10%过硫酸铵100μL；TEMED4μL。迅速加到烧杯后，摇匀。33分离胶混匀后快速用移液器移入玻璃板夹层中，每侧4.8mL。不要出现气泡，若出现，立即

4、用微量注射器吸出。4小心地在分离胶表面加一层水，封住胶面，使凝胶表面平直，凝胶在室温下放置大约40分钟。用移液器沿着玻璃板上方从左向右轻轻加双蒸水，至加满玻璃板夹层。5制作5%浓缩胶：专用烧杯中加入30%丙烯酰胺贮液1.3mL；双蒸水5.5mL；1.5mol/LTris-HCl（pH6.8）1.0mL；10%SDS80μL；10%过硫酸铵80μL；TEMED8μL。迅速加到烧杯后，摇匀。6倒掉玻璃板夹层中的水，用浓缩胶缓冲液贮液淋洗凝胶，用移液器灌注浓缩胶至灌满玻璃板为止。同第3步。7迅速插入与模具大小相同，与凝胶厚度相当的梳子。梳子需一

5、次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平。8浓缩胶凝固后（约40分钟），拔掉梳子，向胶槽中倒入电泳缓冲液，用微量注射器冲洗加样孔。指导学生正确处理实验废弃物。9点样，每孔上样体积为10µL。教师演示操作过程。10电泳：90V电压进行电泳，当溴酚蓝前沿到达浓缩胶和分离胶交界处时改用120V电压，至溴酚蓝前沿到达分离胶底部时停止电泳。引导学生思考；为什么在电泳过程中要换电压？11染色：电泳结束后，将胶转入染缸中，先用双蒸水冲洗一遍。加入考马斯亮蓝R-250染色液，放在脱色摇床上染色30min后，将考马斯亮蓝R-250染色液倒掉，用冰醋酸-甲醇

6、脱色液冲洗15s，再将凝胶放入脱色液中，至凝胶背景为无色时为止。先用小刀撬开玻璃板的一角，然后分开玻璃板。12将已脱色凝胶放在两层透气玻璃纸中间，自然干燥获得电泳图谱，拍照。3实验结果及分析(1)图1可以看到清晰的蛋白质谱带，从上到下的分子量依次为97.2KDa、66.4KDa、44.3KDa、29.0KDa、20.1KDa、14.3KDa。3SDS-PAGE电泳图谱(2)为什么在电泳图谱上分子量小的在下面而分子量大的在上面？教师指导：根据实验原理来进行分析。学生分析讨论、回答。教师总结：聚丙烯酰胺凝胶是网状结构，具有分子筛效应，可以根据

7、蛋白质分子大小的不同而分离蛋白质，电泳时，分子量小的蛋白质跑的快在下面，而分子量大的蛋白质跑的慢在上面。(3)与图1电泳图谱相比，有些图谱有这样或那样的瑕疵（图2-3），有些的图谱很不理想（图4-6），请查资料，回想实验过程，分析失败的原因。有兴趣的同学，可以重复操作，直到得到满意的电泳图谱为止。主要参考文献[1]郭尧君.蛋白质电泳实验技术[M].北京:中国科学出版社,1992,123-156.[2]J.萨姆布鲁克，E.F弗里奇，T.曼尼阿蒂斯著，金冬雁，黎孟枫等译.分子克隆实验指南(第二版)[M].北京：科学技术出版社.3