高效液相色谱讲义1

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1、第七章高效液相色谱法第一节概述一、史程、专用术语二、色谱分离过程和类型液固吸附色谱液液分配色谱离子交换色谱离子对色谱空间排阻色谱三、色谱流程和仪器四、HPLC的特点速度快，分辨率高，灵敏度高、柱子可反复使用第二节基本理论一、色谱分离过程（一）液-固吸附色谱流动相为液体，固定相为固体吸附剂，根据物质吸附作用的不同来分离物质。流动相和固定相都是液体的色谱法即为液-液色谱，是利用样品组分在两种不相溶的液相间的分配来进行分离。一种液相为流动相，另一种是涂渍于载体上的固定相。（二）液-液分配色谱流动相极性小于固定相极性的液-液色谱法称为正相分配色谱法流

2、动相极性大于固定相极性的液-液色谱法称为反相分配色谱法（三）离子交换色谱（四）离子对色谱法（五）分子排阻色谱法二、色谱流出曲线和保留值（一）色谱流出曲线及相关术语（二）保留值三、分离度第三节定性和定量分析一、定性分析（一）利用已知物对照法定性1、利用保留特性2、利用不同柱比较（二）色谱法和其他方法结合定性1、利用化学反应定性2、利用二极管陈列检测器3、收集峰的流出物4、HPLC-MS二、定量分析（一）峰面积或峰高的测量方法1、手测峰高2、峰高乘半峰宽3、剪纸称重4、积分仪测定5、微处理机测定（二）定量方法1、峰面积归一法2、外标法3、内标法4

3、、内加法（或追加法）第四节高效液相色谱的分离模式一、基本原理二、分类1、吸附色谱2、分配色谱3、离子交换色谱4、分子排阻色谱5、亲和色谱三、HPLC在生物大分子中的应用在生物大分子中的HPLC中，体积排阻色谱，离子交换、反相液相和亲和色谱是最常用的分离模式。第五节液-固色谱法液-固色谱法通常称为吸附色谱1、载体：硅胶2、吸附剂吸附试样的能力3、原理第六节键合相色谱法一、正相色谱法1、在正相色谱法中共价结合到载体上的基团都是极性基团。2、分离机制属于分配色谱3、主要用于分离极性不同的化合物，特别是用来分离不同类型的化合物。二、反相色谱1、分离机

4、理2、固定相3、流动相第七节离子交换色谱离子交换色谱是以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团，当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交换，根据组分离子对树脂亲和力不同而得到分离。按结合的基团不同，离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。种类阳离子交换树脂强酸性弱酸性阴离子交换树脂强碱性弱碱性离子交换层析适用性能在水溶液或含水极性溶剂中产生游离离子基团的酸、碱及两性成分。可用于氨基酸、肽类、生物碱、有机酸、酚类等水溶性成分的分离。使用离子交换剂使物质分离表样品

5、强酸型(磺酸型)稀NH4OH洗脱通过液酸性、中性化合物解离型、两性化合物稀NaOH洗脱强碱型(季铵型)强碱型稀HCl洗脱通过液通过液酸性化合物中性化合物解离型物质两性化合物(盐、生物碱)一、离子交换色谱的分离机理1、不足之处：忽略了在填料表面上形成复合物时溶质被流动相中小分子饱和并不断进行计量置换反应的重要因素。2、P0：流动相中溶质的浓度Pb：填料表面上被吸附的溶质浓度D0：流动相中洗脱剂的浓度Db：填料表面上洗脱剂的浓度Z：是蛋白质在吸附过程中从填料表面上被置换的洗脱剂的数目。①Z可以小到忽略不计，反应常数变为分配系数②在

6、Z值不能忽略时在等度洗脱蛋白质的过程中，容量因子K’与保留体积成比例，同时洗脱过程中，Kd，Db是常数，用Kz表示。3结论二、离子交换色谱的固定相1、高分子类型填料①优点a填料的使用寿命长b具有较高的色谱容量c很少有非特异性吸附，对于保持样品生物活性有利。②结构以交联共聚的苯乙烯-二乙烯苯为基质，同时也出现了许多其他交联高聚物基质的固定相。③类型MonoBeadsTSK-gelDEAE-5PWSP-5PWCM-5PW2、无机基质型三、离子交换色谱的流动相1、流动相的PH值①离子交换容量受流动相的PH值影响②改变流动相PH值，也会影响弱电离的酸

7、性或碱性组分的电离情况，因而改变组分的保留值。③流动相PH值的变化也能改变分离的选择性④对流动相PH值的控制，通常采用缓冲溶液来实现。2、流动相的离子强度四、离子交换色谱的影响因素1、填料孔径的影响2、柱长的影响3、流速的影响4、PH值的影响无论在强的还是弱的阴离子交换柱上，蛋白质均显示不同PH值影响结果，因此决定了它的保留选择性、分离度和回收率等因素。5、离子强度的影响第八节体积排阻色谱法一、分离机理1、体积排阻色谱法（SEC）或空间排阻色谱法（SEC）或凝胶色谱法2、凝胶过滤色谱法（GFC）Sephadex葡聚糖凝胶3、凝胶渗透色谱法（G

8、PC）4、空间排斥理论①②V0死体积，相当于凝胶的粒间体积Vs色谱柱中凝胶的孔穴总体积二、体积排阻色谱法的特点三、体积排阻色谱法的固定相（一）固定相的分类1、按固定