藻蓝蛋白实验报告

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1、藻蓝蛋白的分离与纯化姓名：郭均学院：食品与生物工程班级:食安09-2学号：200906041069藻蓝蛋白的分离与纯化一、实验目的和要求1、了解藻蓝蛋白的生理意义及功能，藻蓝蛋白的一般提取和纯化的方法;2、掌握蛋白含量测定方法；3、掌握盐析和离子交换层析纯化蛋白的分析技术。二、实验原理藻蓝蛋白（PC）是一类普遍存在于藻蓝蛋白中的光合辅助色素，也是一种天天然色素蛋白，具有水溶性，可用作视频着色剂。此外，它具有强烈的荧光，在分子生物学上被制成荧光探针，是一种无毒、无副作用的理想光敏剂。藻蓝蛋白还具有重要的医疗价值，不但能提高机体

2、的非特异性免疫功能，而且对特异性免疫功能有促进作用。另外它还有清除自由基的能力，可以抗疲劳，延缓衰老，对人体的牛理功能有重要的牛物学意义。利用盐析沉淀蛋白质的基本原理：盐在水溶液中电离所形成的止负离子可吸收水分子，从而夺取蛋口质分子上的水化膜，还可以中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。由于各种蛋白颗粒大小、所带电荷的多少及亲水程度不同，当使用某种中性盐对其进行盐析吋，所需的最低盐浓度各不相同。研究表明可用25%硫酸鞍饱和度沉淀除去杂质，55%硫酸鞍沉淀藻蓝蛋白。盐析出来的蛋白质，需通过脱盐以除去硫酸钱

3、等盐类物质。最常用脱盐的方法是透析。蛋口质是大分子物质，它不能透过半透膜，故不断更换蒸馆水或缓冲液可将盐类等小分子杂志透析掉。蛋白质含量测定有紫外分光光度计法和显色法（Folin-酚法、考马斯亮蓝法等），木实验釆用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的含量，考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用后变为蓝色，最大光吸收由465nni变为595nm,在一定范围内，蛋口质含量与595nm处吸光值成正比。离子交换层析法纯化蛋白质，常用的阳离子交换剂有弱酸性的竣甲基纤维素（CM纤维素），阴离子交换剂有弱碱性的二乙胺

4、基乙基纤维素（DEAE-纤维素）。蛋白质的混合物与纤维素离子的交换剂的酸性基团或碱性基团结合，结合力的大小取决于彼此间相反基团的静电引力，这又与溶液的pH有关，因为pH决定离子交换剂和蛋口质的解离程度。盐类的存在可以降低离子交换剂的解离基团与蛋白质相反电荷Z间的静电引力。因此，被吸附的蛋白质的洗脱通过改变pll或离子强度来实现，与离子交换剂结合力小的蛋白质先从层析柱中洗脱下来。木实验以蓝藻为材料，采用反复冻融、分步盐析法对藻蓝蛋白进行提取和初步纯化，采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的含量，然后使用DEAE-纤维素柱层析对提取

5、的藻蓝蛋口进一步纯化（由于来源不同和种类的差别，冃前研究报道的藻蓝蛋白等电点尚无一致结论，但都在3.4-4.8Z间，其屮钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的等电点为4.3,在pH6.5磷酸盐缓冲液中带负电，所以选择DEAE-纤维素阴离子交换柱）。预期得到纯度较高的藻蓝蛋白。三、试剂与仪器1、试剂螺旋藻藻粉0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pII6・5）:配置0.2mol/LpI16.5硫酸缓冲液；称取磷酸二氢钠32.21g溶于蒸徭水稀释至1000mL为A液。称取磷酸二氢钠71.64g溶于蒸谓水稀释至1000mL为B液。取A液68.5mL,B液

6、31.5mL,混匀后即可。稀释0.2mol/LpH6.5硫酸缓冲液20倍得0.01mol/LpH6.5硫酸缓冲液。标准蛋白（0.lmg/mL）:结晶牛血清蛋口，预先经微量凯氏定氮法测定蛋口氮含量，根据其纯度配制成0.lmg/mL的蛋白质标准溶液。考马斯亮蓝G-250：称取100吨考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，加蒸谓水稀释至lOOOmLo0.5mol/LNaOH0.5mol/LHCINaCl硫酸鞍透析袋DEAE-纤维素奈氏试剂：将10g碘化汞和7g碘化钾溶于水中，另将24.4氢氧化钾溶

7、于内有70mL水的100n±容量瓶中，并冷却至室温。将上述碘化汞和碘化钾溶液注入容量瓶中，边加边摇动。加水至刻度，摇匀，放置2天后使用。试剂保存在棕色试剂瓶屮，暗处。四、实验步骤（-）藻蓝蛋白的提取及初步纯化1、藻蓝蛋白抽提：采用反复冻融法破碎细胞，磷酸盐缓冲液浸提蛋白。具体操作：取螺旋藻粉lg,加入0.Olmol/LPh6.5的磷酸盐缓冲液10ml,充分搅拌均匀。室温浸泡30min-lh后，在-20°C和38°C之间反复冻融数次（3-5次）。细胞破碎后，将悬浮液移入离心管，加入10mL0.Olmol/LPh6.5的磷酸盐缓

8、冲液,混匀，静止30min,4000r/min离心20min,上清液即为抽提得到的藻蓝蛋白混合液。2、分步盐析：采用不同浓度的硫酸钱分步盐析初步纯化岀藻蓝蛋白。具体操作：取上清液，用25%饱和度的硫酸钱4°C盐析30min,然后4000r/min离心20min,所得上清液用55%饱和度的硫