小鼠组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)检测试剂盒说明书.doc

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1、小鼠组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)检测试剂盒说明书小鼠组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)检测试剂盒该试剂盒以HRP标记的链霉亲和素复合物(HRPStreptavidinConjugate,HRP-SA)为基础,可用于检测血液,细胞、组织内的特异性CD40抗原。该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、定性定位准确、背景清晰。在所用的CD40一抗与相应靶抗原结合后,用生物化二抗与一抗特异性结合,最后加入HRP-SA,形成抗原—特异一抗—生物素化二抗—HRP-SA复合物,显微镜下观察成像。小鼠组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)检测试剂盒试剂盒所含试剂:试剂A通透液:

2、0.1%Triton-X10010mL(选用)试剂B封闭缓冲液(封闭用)20mL试剂C(原装进口分装)已稀释的即用型CD40一抗(2.5ml)试剂D(原装进口分装)生物素化羊抗兔IgG1支(浓度1.5mg/mL,稀释比为1:300~1:500)50μL+抗体稀释液20ml试剂EHRP-SA复合物1支(浓度1μM,稀释比1:50~1:200)100μL试剂FDAB显色液5ml用户自备试剂:1.10mMTBS(pH7.2~7.4)三羟基氨基甲烷1.21g氯化钠7.6g加蒸馏水800mL,浓盐酸调pH值至7.2~7.4,最后定容至1000mLTBS-T:T

3、BS+Tween20(0.05%体积比)2.抗原修复液(依检测抗原不同而选择不同的修复液)10mMpH6.0柠檬酸缓冲液柠檬酸0.38g柠檬酸三钠2.45g加蒸馏水900mL,浓盐酸调pH值至6.0,最后定容至1000mL或:0.5MEDTA修复液(pH8.0)EDTA·2H2O186.1g加蒸馏水700mL,用10mMNaOH调pH值至8.0,最后定容至1000Ml3.缓冲甘油封固剂10mL4.Tween205mL石蜡包埋组织切片免疫染色实验步骤(建议方案):石蜡包埋组织切片3~4μm厚度1.烤片:将待做切片置于切片架上,于60℃恒温烤箱中至少烤1

4、hr;2.脱蜡:切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡3次(即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),每次10min;3.水化:切片经下行酒精水化,无水乙醇5min,95%乙醇2次(每次2min),85%乙醇2min;75%乙醇2min,自来水冲洗,ddH2O洗2×2min;4.抗原修复:根据抗体说明书推荐方法进行抗原修复,常采用高压、微波(温度达到98~100℃)或酶消化修复法,室温自然冷却,自来水冲洗,ddH2O洗2×2min,TBS洗涤(2×2min)(具体修复方法见附1)*注:有些抗原勿需修复,直接进入第5步封闭。5.封闭:滴加试剂B,37℃湿盒孵育30min;6.加一

5、抗:滴加用试剂C(即用型一抗),37℃湿盒孵育2hr或4℃过夜;7.洗涤:TBS-T洗涤(3×5min);8.封闭:滴加试剂B,37℃湿盒孵育10min;9.加二抗:滴加用抗体稀释液稀释的生物素化二抗(试剂D),37℃湿盒中孵育30min;10.洗涤:TBS-T洗涤(3×5min);11.封闭:滴加试剂Tween20,37℃湿盒孵育封闭20min;12.加HRP-SA:滴加用试剂C稀释的试剂E(1:50~200,终浓度5~20nM),37℃湿盒中孵育30min;13.洗涤:TBS-T洗涤(3×5min),TBS洗涤(2×5min);14.显色:应用D

6、AB溶液(试剂F)显色;15.复染:自来水充分冲洗,复染,脱水,透明;16.封片:待组织标本干后,用试剂缓冲甘油封固剂封片;17.观察成像:显微镜下观察成像。注意事项:1.修复后缓冲液须自然冷却,自来水冲洗后方能把切片取出,骤冷有可能导致结晶或抗原封闭。2.缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到,用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用。3.若试剂为微量浓缩液,用前应低速离心,将内盖和管壁附着的溶液离到底部。4.封片前一定要换用TBS充分洗涤,以便洗去组织上残留的Tween20,否则会影响结果观察。5.如须复染细胞核,则在封片前复染或直接采用含有染核试剂的封片剂

7、进行封片。附1:抗原修复方法常用抗原修复液:柠檬酸缓冲液(0.01MpH6.0)、EDTA抗原修复液(pH8.0或9.0)等等。一、酶消化修复法酶消化修复切片脱蜡水化处理,TBS冲洗,在组织上滴加胃蛋白酶或胰蛋白酶,37℃孵育20~30min后TBS冲洗即可。二、微波抗原修复法微波盒中加入抗原修复液微波加热至沸腾,将脱蜡水化后的切片置于耐高温塑料切片架上,放入已沸腾的缓冲液中,中档或高档继续微波10~15min,取出微波盒冷却至室温后,自来水冲洗,取出切片。因不同微波炉微波处理时间存在差异,须自行调整。三、直接高压抗原修复法取修复液于不锈钢高压锅中加

8、热至沸腾,将组织切片置于耐高温切片架上,修复液沸腾后放入切片架,盖上锅盖,待喷气后计时1.5~2.5min即

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