植物基因组dna的提取及分析

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1、菟1A抽提CTAB法提取植物基因组DNA原理_去蛋白（酚/氯仿抽提）去隱（RNase消化）_纯化DNA去盐（70%乙醇漂洗）上涪相交性蛋白有机相RNase演化乙酵沉淀电泳分析乙酵深洗这种方法是由Murray和Thompson（1980）修改而成的简便方法。CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（（0.7mol/LNaCI）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3mol/LNaCI）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白、多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTA

2、B溶于乙醇或异丙醇而除去。(1)2XCTAB溶液CTAB(W/V)Tris-HCIEDTA2%100mmol/L(pH8,0)20mmol/L(pH8.0)PVP1%灭菌备用。没灭菌前呈粘稠状，CTAB灭菌后变成清亮的溶液(1)氯仿/异戊醇(24:1)(2)RNaseA10mg/ml(不用)(3)乙醇或异丙醇(4)3-巯基乙醇(5)70%乙醇操作程序■1.在2mL离心管中，加入500nI的2XCTAB，65°C预热，用前加入20PlP-巯基乙醇。■2.嫩的组织材料1-2g，用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷

3、的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中，总体积达到1mL混匀后置65°C水浴中保温45-60min，并不时轻轻转动试管。■注：冻存材料直接研磨，绝对不能化冻。而且粉末应在化冻前转移，否则内源性DNase有可能降解基因组DNA。■3.加等体积的氯仿/异戊醇，轻轻地颠倒混匀，室温下10OOOrpm离心10min，移上清至另一新管屮。4.加入2倍体积的100%乙醇或0.7倍体积异丙醇，会出现絮状沉淀，-20*€放置3011^或-80°（：放置100^，12OOOrpm离心10-15min回收DNA沉淀

4、。■5.用70%乙醇清洗沉淀两次，吹干后溶于适量的灭菌ddH20或TE缓冲液中■6.0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。电泳分析基因组DNA的完整性烟草基因组DNA电泳图谱M:XDNA/HindlllMarker1,2:基因组DNA完整性好的基因组DNA应是-•条比23Kb滞后的电泳带，若降解则成为弥散状。电泳前缘为未除干净的RNA。可能出现的问题及解决方案1.如果DNA沉淀呈A色透明状而且溶解后成粘稠状，说明DNA含有较多的多糖类物质，可以在取材前将植物放喑处24hr，以达到去除淀粉的目的。2.如果DNA沉淀呈棕色，难

5、以用限制性内切酶完全消化植物材料含有大量酚类化合物，与DNA共价结合，使DNA呈棕色，并抑制DNA的酶解反应。为防止此情况出现，可在加入2XCTAB的同时加入2-5%的巯基乙醇，或者加入亚精胺（100ulDNA加5ulO.1mol/L的亚精胺）。1.DNA中含有多糖或盐类将DNA用100%乙醇或异丙醇沉淀出来，离心，沉淀用70%乙醇清洗两次或更多次，吹干后重溶于TE中。（注意乙醇一定要吹干，否则电泳点样时，样品上漂）2.DNA已降解电泳条带呈弥散状样品降解可能有两种情况：一是机械振动过剧烈，二是操作过程中DNase污染。在提取DNA

6、的各个操作过程中要避免剧烈振荡，提取液及用品要高温高压灭菌。另外，使用吸头吸取过程中应避免产生气泡，吸头应剪去尖部，避免反复冻融DNA。